血清miR-1、miR-21在冠心病患者PCI術后病變冠狀動脈再狹窄預測中的應用

王紅，任明，樊世明，沈有錄，趙瓊瓊

(青海大學附屬醫院，西寧 810001)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)是指冠狀動脈血管粥樣硬化病變致血管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血缺氧、甚至壞死而引起的心臟病[1]。經皮冠狀動脈介入術(PCI)是目前臨床治療冠心病的重要手段，但術后再狹窄發生率為10% ～20%，嚴重影響患者預后[2]。PCI術后冠狀動脈造影檢查或血管內超聲檢查是確診冠狀動脈再狹窄的“金標準”，但是此時確診再狹窄已經延誤治療最佳時機，也可能因二次手術而造成重大疾病負擔。尋找靈敏度高、特異度好的標志物早期預測PCI術后冠狀動脈擴張部位再狹窄，對降低再狹窄發生率及提高患者預后有重要意義。微小RNA(miRNA)是主要在真核生物中表達的單鏈小分子RNA，不編碼蛋白質，主要介導細胞的增殖、分化、凋亡等病理生理過程[3]。研究[4]發現，miRNA異常表達可能介導了缺血性心臟病發病過程。miR-1和miR-21屬miRNA家族成員，兩者與惡性腫瘤[5,6]發生發展密切相關，而關于其與冠心病PCI術后冠脈再狹窄的關系目前鮮有研究。本研究通過檢測冠心病患者PCI術后血清miR-1、miR-21，并探討其在術后病變冠狀動脈再狹窄預測中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年12月青海大學附屬醫院收治的103例行PCI治療后6個月內的冠心病患者作為研究對象。納入標準：①臨床癥狀、超聲心動圖結合實驗室檢查等確診為冠心病，并符合冠心病診斷標準[7]；②PCI術后再狹窄的診斷標準[8]：經血管內超聲檢查提示患者原擴張部位支架內以及節段內的血管腔直徑縮小超過50%。排除標準：①孕產婦以及哺乳期的婦女；②肝、腎功能障礙者；③急、慢性炎癥性疾病；④自身免疫性疾病；⑤冠狀動脈多支病變、血管慢性堵塞再通患者；⑥泵衰竭Killip Ⅲ級以及Ⅲ級以上的患者；⑦惡性腫瘤患者。根據PCI術后6個月患者血管內超聲結果提示是否存在再狹窄將所有患者分為兩組，再狹窄組42例，男25例，女17例；年齡37～79(56.23±8.91)歲；病變部位在前降支17例，右冠脈20例，回旋支5例。未狹窄組61例，男38例，女23例；年齡41～75(58.12±8.25)歲；病變部位在前降支20例，右冠脈29例，回旋支12例。另選30例同期健康體檢者作為對照組，男19例，女11例；年齡35～81(56.98±9.05)歲。兩組一般資料無統計學差異，具有可比性。本研究得到醫院倫理委員會的批準，研究對象及家屬均在知情同意書上簽字。

1.2 血清miR-1、miR-21檢測 收集各組清晨空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min的速度離心10 min，棄去血漿溶液后再以3 000 r/min的速度離心10 min，留取上清液裝于未含RNA酶的試管中，置于-80 ℃環境下保存。根據RNAisoTMPlus試劑盒說明提取總RNA，以異丙醇沉淀法濃縮RNA后采用NanoDrop?ND-1000對RNA的濃度進行檢測，并評估其純度。RT-PCR法檢測miR-1、miR-21，嚴格按照RT-PCR試劑盒說明進行相關操作，反應體系20 μL，包括2×Taqman通用的PCR預混物10 μL，20×miRNA特異度引物1 μL，cDNA 1.33 μL，蒸餾水7.67 μL。反應條件：95 ℃變性、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共循環50次，實驗重復3次。采用Primer5軟件設計引物序列，miR-1：5′-AGCG-GCAGAATCAGGAGTA-3′，5′-GAGGACCTTGGAGGCAG-AC-3′，350 bp；miR-21：5′-GCCCATCCTCAAATACAAAG-C-3′，5′-GGTCCYGAACACAAAATG AGC-3′，335 bp；β-actin：5′-CTCATTGACAATGGTGAT-3′，5′-ACCGAGCGC-GGCTACAGC-3′，650 bp。采用2-ΔΔCt表示miR-1、miR-21的相對表達量。

1.3 血管內超聲檢查 PCI術后定期門診隨訪，并在PCI術后6個月對所有患者行血管內超聲檢查，檢測儀器為Boston Scientific Clearview血管內超聲儀。具體步驟：肝素抗凝后將硝酸甘油注入冠狀動脈內，超聲探頭為2.5 F，頻率為40 MHz，到達動脈狹窄病變處遠段后將探頭導管以0.5 mm/s的速度回撤，分別測量支架內病變、病變近端和遠段10 mm處各3次。根據美國心臟病學院血管內超聲測定指南[9]測量外彈力膜內橫截面積(EEM)、最小管腔面積(MLA)、斑塊面積(PLA)，并計算狹窄程度(RS%)。

2 結果

2.1 各組血清miR-1、miR-21表達比較 結果見表1。

表1 各組血清miR-1、miR-21表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與未狹窄組比較，△P<0.05。

2.2 兩組血管內超聲檢查相關指標比較 結果見表2。

表2 兩組血管內超聲檢查相關指標比較

注：與未狹窄組比較，*P<0.05。

2.3 血清miR-1、miR-21與血管內超聲檢查相關指標的相關性 狹窄組患者血清miR-1與miR-21表達呈負相關(r=-0.762，P<0.05)，miR-1與EEM、MLA呈正相關(r=0.611、0.572，P均<0.05)，miR-1與PLA、RS呈負相關(r=-0.538、-0.615，P<0.05)；血清miR-21表達與EEM、MLA呈負相關(r=-0.593、-0.624，P均<0.05)，與PLA、RS呈正相關(r=0.509、0.637，P均<0.05)。未狹窄組患者血清miR-1與miR-21表達無明顯關系(P>0.05)，miR-1、miR-21與EEM、MLA、PLA、RS無相關(P均>0.05)。

2.4 血清miR-1、miR-21預測冠心病患者PCI術后再狹窄的價值 當miR-1的AUC為0.770(95%CI0.676～0.864)，此時最佳截斷值為0.36，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.82、0.87，準確性為0.83；當miR-21的AUC為0.750(95%CI0.648～0.852)，此時最佳截斷值為0.79，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.79、0.85，準確性為0.80；miR-1聯合miR-21的AUC為0.928(95%CI0.877～0.980)，診斷再狹窄的靈敏度、特異度分別為0.89、0.93，準確性為0.87。詳見圖1。

3 討論

近年來，隨著社會節奏的加快及生活壓力的增大，冠心病發病率逐漸增加，并呈年輕化趨勢，嚴重威脅人們的健康和生命質量[10]。PCI是目前臨床治療冠心病的重要手段，它能有效減少不穩定性心絞痛患者病死率，提高非致死性心肌梗死、難治性心絞痛患者預后[11]。再狹窄是指PCI術后6個月行冠狀動脈造影發現冠狀動脈血管管腔直徑縮小超過50%，其形成機制主要是血管內膜過度增殖[12]。文獻[13]報道，PCI過程易損傷動脈血管內皮細胞，引起炎癥反應、血栓、血管內膜異常增殖等，進而形成血管新生內膜、血管重塑等，最終導致血管再狹窄。冠心病患者PCI術后如何減少擴張部位再狹窄，提高預后已成為臨床研究熱點。

圖1 血清miR-1、miR-21預測冠心病患者PCI術后再狹窄的ROC曲線

miRNA長度約為18～25個核苷酸，是由內源基因編碼的非編碼單鏈小分子RNA，它通過互補配對的方式與3′端片段特異度結合而抑制mRNA的正常合成，進而調控靶基因的表達[14]。研究[15]表明，miRNA參與了心血管疾病、惡性腫瘤的發生發展過程。Wang等[16]認為，miR-1、miR-208、miR-133在急性心肌梗死患者中表達異常，證實miRNA可作為心肌損傷的重要標志物。Meder等[17]通過研究miR-145、miR-30c與肌鈣蛋白的關系證實miRNA介導了心臟疾病的發病過程。miR-1為肌細胞特異度miRNA，其表達上調對心室肌細胞的增殖具有抑制作用[18]。張亦等[19]發現，miR-1在動脈粥樣硬化閉塞癥、行血管重建術后再狹窄患者病變的動脈血管中表達下調，再狹窄患者尤其明顯。Jiang等[20]認為，miR-1通過表達上調而調控主動脈收縮型血管平滑肌細胞中血管平滑肌細胞的收縮能力和增殖水平。miR-21屬于miRNA家族成員，其在大鼠頸動脈球囊血管成形術后表達上調，而抑制miR-21表達后，發現細胞凋亡增加[21]。另有研究[22]也發現，miR-21異常表達參與了心臟疾病的發生過程。

本研究顯示，再狹窄組、未狹窄組患者血清miR-1表達低于對照組、miR-21表達高于對照組，再狹窄組血清miR-1表達低于未狹窄組、miR-21水平高于未狹窄組，提示miR-1、miR-21與冠心病患者PCI術后再狹窄有關，可能是因為miR-1、miR-21異常表達促進冠狀動脈血管內膜細胞的異常增殖，導致血管新生內膜形成和血管重塑，最終發生血管再狹窄現象。本研究還顯示，再狹窄組患者EEM、MLA低于未狹窄組，PLA、RS高于未狹窄組，提示EEM、MLA、PLA、RS是評估動脈血管腔狹窄程度的重要指標。

相關性分析顯示，狹窄組患者血清miR-1與miR-21水平呈負相關；miR-1與EEM、MLA呈正相關，與PLA、RS呈負相關；miR-21與EEM、MLA呈負相關，與PLA、RS呈正相關；提示miR-1、miR-21通過協同作用促進冠心病患者PCI術后再狹窄的發生。AUC顯示，miR-1、miR-21對冠心病患者PCI術后再狹窄具有較高的預測價值，且聯合檢測能明顯提高預測價值。

總之，miR-1、miR-21異常表達與冠心病患者PCI術后再狹窄密切相關，早期聯合檢測能有效預測PCI術后再狹窄，可為臨床制定針對性干預方案，提高患者預后提供重要參考。