鋅原卟啉-9腹腔注射對腦出血大鼠神經功能的改善作用及其機制

吳丹，張曼青，殷小平，周君，陳志穎，鮑兵

(1江漢大學附屬醫院 武漢市第六醫院，武漢 430015；2九江學院基礎醫學院；3九江學院附屬醫院；4上海交通大學附屬第六人民醫院)

腦出血(ICH)是指原發性非外傷性腦實質出血，臨床表現為頭痛、癲癇及神經功能缺損，有較高的發病率和致死率[1,2]。ICH后繼發的腦組織損傷是影響患者預后、轉歸的關鍵因素[3]，而炎癥因子及自由基的瀑布式產生對ICH后繼發性腦損傷起決定性作用[4,5]。現有的治療不能很好地控制ICH后繼發性腦損傷的發展。研究[6]發現，血紅素加氧酶-1(HO-1)在中樞神經細胞(神經元及膠質細胞)中廣泛表達，是核轉錄因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)信號通路下游的重要抗氧化及解毒蛋白，對ICH后繼發性腦損傷具有抗炎癥反應、減輕氧化應激損傷、抑制細胞凋亡等神經保護作用。本研究運用HO-1的選擇性抑制劑鋅原卟啉-9(ZPP-Ⅸ)抑制HO-1表達，觀察用藥后Nrf2-ARE通路上下游蛋白Nrf2、NF-κB、TNF-α等表達的變化及神經功能評分差異，探討HO-1對ICH灶周神經保護作用的機制，為ICH后繼發性腦損傷治療提供新的實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 95只普通級雄性SD大鼠，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[證書編號:SDXK(湘)2009-0004]，質量250～300 g。按隨機雙盲原則分成ZPP-Ⅸ組(30只)、ICH組(30只)、DMSO組(30只)、正常組(5只)。

1.2 主要試劑 ZPP-Ⅸ(50 mg ZPP-Ⅸ溶于35%DMSO，終濃度10 mg/mL，給藥劑量10 mg/kg)；DMSO一抗：Anti-Nrf2兔來源多克隆抗體，Anti-HO-1兔來源多克隆抗體，NF-κB兔來源單克隆抗體，TNF-α兔來源單克隆抗體，Anti-CD-11b兔來源多克隆抗體，β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(70-Mab1445)；二抗：羊抗小鼠多克隆抗體帶Cy3熒光素，羊抗兔多克隆抗體帶FITC熒光素；Odyessy二抗(1∶15 000)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒；DAPI染色試劑；硝酸纖維素膜(NC膜，0.45 μm)；BCA試劑盒；蛋白酶抑制劑cocktail；上樣緩沖液。

1.3 ICH模型制備及ZPP-Ⅸ給予方法 參照文獻[7]的方法將ZPP-Ⅸ組、ICH組、DMSO組大鼠于腦立體定位儀上緩慢注射自體股動脈血50 μL至基底節區，制備ICH模型；正常組大鼠于相同部位打孔進針，不注血。參照Gareia18分測評法[8]，將神經功能缺陷評分≥3分及腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規則的血腫存在定義為模型制備成功標準；血液沿針道反流、流入腦室或死亡者均剔除，剔除后補充相當數量并制模成功的大鼠。ZPP-Ⅸ組在制模后30 min內腹腔注射10 mg/kg ZPP-Ⅸ[9]，DMSO組給予10 mg/kg的35%DMSO，正常組、ICH組均給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠神經功能評價 采用Gareia18分測評法評價制模前24 h及制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d大鼠神經功能，共分為6項，即自發活動、輕癱試驗、前肢運動、加強運動功能、痛覺、深感覺，神經功能缺損最嚴重計0分，無神經功能缺損計18分。

1.5 大鼠腦組織Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白檢測 取各組大鼠，于制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d麻醉開胸，迅速暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口，4 ℃生理鹽水200 mL灌注后至流出液體清亮，換4%多聚甲醛灌注固定至老鼠肢體僵硬；斷頭取腦，腦組織迅速放入液氮(-80 ℃)中速凍，最后用錫紙包好保存于-80 ℃冰箱中備用。將大腦從-80 ℃冰箱中取出，迅速取血腫灶周3 mm腦組織，采用Western blotting法檢測Nrf2、binding-Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白。最后紅外線雙色激光成像分析機掃描NC膜后得到的圖像，用Odyessy Version3.0軟件分析，計算目的蛋白與β-actin灰度值比值。

1.6 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA檢測 大鼠處死以及標本獲取方法同“1.5”，采用RT-PCR法檢測制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA。

1.7 大鼠腦組織Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α與小膠質細胞(CD11b標記)共染陽性細胞數計數 大鼠處死以及標本獲取方法同“1.5”，大鼠大腦從-80 ℃冰箱取出，在預冷的多聚甲醛中固定20～30 min，再行切片(5 μm)，然后采用免疫熒光雙標法檢測Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與小膠質細胞共表達情況。Optpro成像分析系統掃描、圖像分析。取ICH灶周范圍內觀察在200倍視野下計數5個不重復視野，得出5個視野的平均數。

2 結果

2.1 各組不同時點神經功能評分比較 結果見表1。

表1 各組不同時點神經功能評分比較(分，

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05；與DMSO組比較，▲P<0.05。

2.2 各組制模后不同時點binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白表達比較 結果見表2。

表2 各組制模后不同時點binding-Nrf2、Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白灰度值比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05；與ZPP-Ⅸ組比較，▲P<0.05。

2.3 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達比較 結果見見表3。

表3 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α mRNA表達比較(灰度值，

注：與正常組比較，*P<0.05；與ICH組比較，△P<0.05。

2.4 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽性細胞數比較 結果見表4。

表4 各組制模后不同時點Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α蛋白與CD11b共染陽性細胞數比較(個，

注：與ZPP-Ⅸ組比較，△P<0.05。

3 討論

ICH后眾多因素參與了繼發性腦損傷的形成，其中灶周炎癥反應與炎癥因子的釋放被認為是造成繼發性腦損傷的主要原因。Nrf2-ARE信號通路是內生的重要的抗氧化、抗炎癥反應的通路[10]，HO-1是其下游重要的抗氧化蛋白，調控其表達是否會影響其上游的激活，目前暫沒有研究報道。ZPP-Ⅸ作為HO-1選擇性抑制劑，被廣泛用于Nrf2-ARE-HO-1信號通路的離體、在體研究[11,12]。

本課題小組前期及既往研究[10,13]發現，Nrf2的激活劑萊菔硫烷可抑制炎癥反應，減輕神經功能損傷，提高下游抗氧化蛋白(如HO-1、NQO-1等)的表達，減輕ICH灶周水腫，提高神經保護作用。在體研究[11]發現ICH后HO-1表達上調的時間點與Nrf2激活的時間點具有高度一致性，進一步說明HO-1是Nrf2下游的一重要蛋白[14]。回顧研究結果[6,15,16]，HO-1對中樞神經系統眾多疾病均具有保護作用。而其在ICH中的作用存在廣泛爭議。表現出的作用與其表達的部位及作用的時間點有關。在神經內皮細胞中表達的HO-1具有較明確的神經保護作用，而在膠質細胞中的HO-1可能具有神經保護作用，但目前證據不足。且HO-1在ICH早期具有神經保護作用，在晚期可能表現出神經毒性作用，但并沒有確切地指出具體時間點。本研究與研究[17～20]大體方向一致，但更確切地闡述了一些關鍵問題。

本研究顯示，與正常組比較，ICH組、ZPP-Ⅸ組、DMSO組制模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經功能評分減少，證明DMSO作為ZPP-Ⅸ溶劑不會加重ICH后神經功能障礙；與ICH組比較，ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的神經功能評分減少，說明ZPP-Ⅸ具有神經毒性作用，可加重ICH后神經功能障礙。本研究還顯示，與正常組比較，ICH組、DMSO組、ZPP-Ⅸ組各時間點HO-1、Nrf2、NF-κB、TNF-α蛋白表達均增加，binding-Nrf2蛋白水平減少，證實ICH后一方面啟動抗炎性、抗氧自由基通路的活化，即通過促進Nrf2入核，另一方面也啟動了炎癥反應的級聯放大;與ICH組比較，ZPP-Ⅸ組12 h、24 h、48 h、72 h及7 d HO-1蛋白表達減少，binding-Nrf2、NF-κB、TNF-α表達增加，提示ZPP-Ⅸ對ICH大鼠Nrf2-ARE信號通路有抑制作用，可能是通過抑制HO-1的表達實現。本文從mRNA表達水平分析得出的結果基本與蛋白的結果基本一致，個別時間點有細微差異。本文研究還發現，與ZPP-Ⅸ組比較，ICH組制模6 h 、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的HO-1與CD11b共表達陽性細胞增加，ICH組制模12 h 、24 h、48 h、72 h、7 d的Nrf2與CD11b共表達陽性細胞增加。說明HO-1可促進Nrf2通路的激活，雖然可一定程度促進下游炎癥因子NF-κB、TNF-α的表達，但Nrf2通路及小膠質細胞激活后可以顯著抑制下游炎癥因子表達從而起到神經保護作用。

總之，ZPP-Ⅸ可能是通過抑制HO-1的表達，從而抑制Nrf2的解離、入核及增加下游NF-κB、TNF-α的表達，來加劇ICH大鼠神經功能損傷的作用。