刺槐素腹腔注射對局灶性腦缺血小鼠腦再灌注損傷的預防作用及其機制

馬志，補娟，朱沂

(1安徽醫科大學新疆臨床學院，烏魯木齊 830000；2新疆維吾爾自治區人民醫院)

腦卒中是導致成年人死亡和慢性殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中約占80%[1,2]，由于大腦中動脈(MCA)供血區的血栓或栓塞引起的局灶性缺血性卒中為最多見。腦卒中發病率和病死率隨年齡的增長而增加，而隨著我國老年人口的迅速增長，缺血性卒中給我國社會和家庭帶來具大的經濟負擔[3]。缺血性腦卒中的病理生理機制復雜，缺血再灌注損傷是最主要也是研究最深入的，包括興奮性毒性、氧化應激、炎癥應答、細胞凋亡等[4]。無菌性炎性應答是腦缺血再灌注損傷的關鍵因素，并且炎癥信號參與腦卒中的所有階段，包括早期損傷事件到后期再生過程的腦組織修復。腦缺血再灌注損傷的炎癥應答主要表現為腦缺血壞死區小膠質細胞的激活，釋放大量的炎癥因子和趨化因子，以及其他有害物質導致神經細胞的壞死，并進一步加重腦缺血損傷[5]，而小膠質細胞作為腦內最主要的免疫細胞被認為是觸發腦內免疫炎癥應答的啟動因子[6]。刺槐素又稱刺槐黃素、金合歡素，屬黃酮類化合物，普遍存在于維管束植物中，可從菊花、刺槐、雪蓮等植物中提取獲得，對神經炎癥性疾病有保護作用。Lin等[7]通過建立紅藻氨酸誘導的興奮性神經退行性疾病模型，發現刺槐素可減少海馬區的神經元死亡，防止興奮性氨基酸引起的神經毒性作用。Ha等[8]認為，刺槐素能抑制脂多糖誘導的小膠質細胞的活化及多種炎癥因子釋放，從而發揮神經保護作用。但刺槐素對腦缺血后再灌注損傷是否有預防作用及其可能的機制尚未見報道。本研究觀察了刺槐素對局灶性腦缺血小鼠腦再灌注損傷的預防作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年清潔級雄性C57BL/6J小鼠36只，體質量25～30 g，由新疆實驗動物研究中心提供[許可證號：SCXK(新)2011-0001]。根據隨機數字表法，將所有小鼠隨機分為刺槐素組、模型組、對照組各12只。

1.2 局灶性腦缺血模型制備及刺槐素給予方法 實驗環境中適應3 d，自由飲水。刺槐素組和模型組小鼠參照文獻[9]方法制備右側局灶性腦缺血模型；腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉(劑量根據小鼠體質量計算)，待麻醉成功后將小鼠以仰臥位固定齒及四肢；手術顯微鏡下行頸部正中縱行切口(5～6 mm)，依次鈍性分離及暴露右側頸總動脈、右側頸外動脈及右側頸內動脈，暫時夾閉頸總動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端并小心電離凝斷頸外動脈，于頸外動脈殘端插入尼龍線(硅膠包被線栓)至大腦中動脈；缺血60 min抽出尼龍線，恢復腦血流再灌。對照組小鼠僅分離頸內動脈，但不閉塞大腦中動脈。術中及術后3 h注意使用白熾頭燈，使小鼠肛溫控制在(37±0.5)℃。刺槐素組和模型組分別于再灌注時給予腹腔注射刺槐素(25 mg/kg)和等量0.9%生理鹽水，對照組于相同時間點腹腔注射等量刺槐素。術后各組小鼠正常飲食和飲水，單籠飼養。

1.3 小鼠神經功能評價 制模24 h后，各組小鼠按照文獻[9]方法進行神經功能評分。由兩位未參與分組及局灶性腦缺血手術的研究人員根據小鼠前爪、轉圈、意識等情況進行評分，無神經功能損傷癥狀或體征計0分，不能完全伸展對側前爪計1分，向癱瘓側轉圈計2分，向癱瘓側傾倒計3分，不能自發行走、意識喪失或死亡計4分。

1.4 小鼠腦梗死體積測算 神經功能評分后，立即采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速斷頭取腦組織，放于-20 ℃冰箱快速冷凍，按1 mm厚度進行冠狀切片，然后將切片放入1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫箱孵育染色20 min，可觀察到正常腦組織染成紅色，而缺血側腦組織則被染為白色并且可見組織腫脹，梗死區域與非梗死區域梗死界限明顯。然后用生理鹽水沖洗腦片3次，后置于4%多聚甲醛中固定2 h。采用 Image pro plus6.0軟件測量各區面積，并計算梗死灶體積，梗死灶體積：V=Σ(S1+S2)×d/2，其中V為總體積，S1和S2分別表示切片頭側和尾側面積，d為切片厚度。

1.5 小鼠海馬區、皮層區Iba-1陽性細胞數計數 0.5%的戊巴比妥鈉深麻醉小鼠后開胸暴露心臟，經左心室分別灌注生理鹽水和4%多聚甲醛后取腦，置于4%多聚甲醛中固定過夜。在前鹵后2～5 mm連續冠狀切片，片厚5 μm，附于多聚賴氨酸包被的載玻片備用。切片經常規脫蠟、水化、微波抗原修復后，按試劑說明書以SP法進行離子鈣接頭蛋白1(Iba1，1∶500)免疫組化染色，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，鏡下觀察腦組織切片，Iba1陽性細胞胞核為棕褐色。每只小鼠隨機選取海馬區和皮層區各5個高倍視野(×400)，應用Image pro plus 5.0 軟件計數Iba1陽性細胞。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能評分比較 刺槐素組、模型組、對照組小鼠神經功能評分分別為(1.67±0.52)、(2.83±0.41)、0分，刺槐素組與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組小鼠腦梗死體積比較 刺槐素組、模型組、對照組小鼠梗死體積分別為(22.15±3.85)、(70.48±12.57)、0 mm3，刺槐素組與模型組比較，P<0.05。

2.3 各組小鼠海馬區、皮層區Iba-1陽性細胞數比較 結果見表1。

表1 各組小鼠海馬區、皮層區Iba-1陽性細胞數比較(個

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著我國老齡人口比重的加大，腦卒中的發病率必會逐年增加。雖然近年來腦卒中的病理機制研究已取得較大進展，但向臨床應用的轉化效果仍不理想。重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)依然是當前治療缺血性腦卒中的主要藥物，但是由于其嚴格的治療時間窗及出血等不良反應，極大地限制了其在臨床的應用。當腦缺血發生后，由于血流的突然中止，氧糖剝奪，隨之而來能量的耗竭、細胞內離子的失衡，在隨后的再灌注復氧階段，大量的活性氧簇的產生，磷脂、蛋白及DNA的損傷以及炎癥的激活，出現細胞腫脹、細胞結構的破壞，從而誘導細胞凋亡和死亡[10]，表現為腦組織的腫脹、壞死和軟化，從而引起一系列的神經功能缺損表現。這其中炎癥應答為關鍵因素，由于炎癥反應的損傷效應可持續數小時至數周，為靶向于炎癥反應的神經保護治療提供了時間窗，所以控制腦缺血損傷后的炎癥應答可能成為缺血性腦卒中治療的重要靶點。

刺槐素為0位甲基化的黃酮類化合物，廣泛分布于植物色素，構成了自然界中的多種顏色。刺槐素的化學結構較簡單，從植物中分離純化較容易，且近年研究[11～13]表明其具有外周抗氧化、抗炎、殺瘧原蟲效果以及抗腫瘤活性，具有良好的應用前景。但刺槐素對局灶性腦缺血后再灌注損傷的預防作用尚未明確。

TTC染色能反應出線粒體的功能狀態，即能很好的顯示出腦缺血再灌注后的腦組織梗死情況[14]。同時對小鼠進行局灶性腦缺血神經行為學評價,既能反映缺血再灌注模型成功與否也能反映出腦缺血再灌注的病理生理過程、組織損傷情況。本研究發現，對照組TTC染色未見梗死發生，神經功能評分亦未見缺損表現，而刺槐素組較模型組上述指標都有顯著改善，說明刺槐素能減少缺血再灌注損傷后小鼠的腦梗死體積，改善梗死后的神經功能缺損癥狀，刺槐素對局灶性腦缺血小鼠再灌注損傷有預防作用。

小膠質細胞作為中樞神經系統特化的巨噬細胞，是參與腦內神經炎癥反應的主要免疫細胞。在生理狀態下，小膠質細胞具有組織防御和保護的作用，支持神經元的功能并維護內環境的穩態，小膠質細胞采用一個高度分支的形態[15]，這個分支形態是以長細胞分枝突起和小細胞胞體為特征，同時細胞分枝不斷移動而胞體保留在原位，能持續不斷的偵查腦微環境動態平衡的任何改變。當危險出現時，小膠質快速活化，即采用大細胞體、少分枝和更加阿米巴形的表型，激活后這些細胞快速作出適當的應答以應對新出現的威脅[16,17]。腦缺血再灌注損傷后，小膠質細胞能夠在腦缺血后數分鐘內激活，并迅速增殖、遷徙以及釋放過氧化物、NO及炎癥因子等，從而加重腦缺血再灌注損傷[18]。小膠質細胞通過其細胞表面豐富的模式識別受體感知中樞神經系統內環境中的各種危險信號。當神經元細胞損傷后釋放出相關的“損傷相關分子模式”與小膠質細胞表面的模式識別受體結合從而觸發下游的免疫應答。比如釋放自壞死的神經元細胞的高遷移率族框1(HMGB1)，HGBM1通過小膠質細胞上Toll樣受體介導卒中后小膠質細胞激活[19]。而抗HMGB1抗體治療減輕了卒中后腦損傷[20]。而本課題組前期研究也發現，通過下調缺血后TLR4表達，雪蓮注射液能夠抑制小膠質細胞增殖及腫瘤壞死因子-κB(NF-κB)活化，減小梗死體積[21]。小膠質細胞表面的模式識別受體除了Toll樣受體家族(TLR)外，還包括晚期糖基化終末產物受體(RAGE)、NOD樣受體家族(NLR)、細胞因子受體以及Notch信號等，比如Fang等[22]研究發現RAGE可在小膠質細胞上表達并誘導NF-κB和MAPK信號通路，引起TNF-α和IL-1β等多個促炎性因子的釋放。小膠質細胞通過表面的受體及相關的信號通路形成一個相互作用、相互補充的炎癥階聯反應網絡來完成卒中后的免疫應答。另外，Iba1是一種能特異性的表達在腦內小膠質細胞中的離子鈣接頭蛋白，當腦缺血發生時小膠質細胞內Iba1的表達隨之增加，故而Iba1常故而小膠質細胞的標志物[23]。本研究顯示，刺槐素組和對照組小鼠海馬區、皮層區Iba-1陽性細胞數較模型組少，提示在腦缺血再灌注損傷后小膠質細胞大量擴增并激活，并且刺槐素能通過抑制小膠質細胞的增殖及激活，從而抑制小膠質細胞活化后的炎癥信號通路的啟動來保護神經元細胞。

總之，刺槐素對局灶性腦缺血小鼠再灌注損傷有預防作用，其機制可能與抑制小膠質細胞的增殖及激活，從而抑制小膠質細胞活化后的炎癥信號階聯反應有關。