加味五虎追風散灌胃對帕金森病大鼠腦組織多巴胺能神經元自噬活性的影響及機制

陳煒，梁健芬，蔣凌飛，吳林，張興博

(1廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023；2廣西中醫藥大學)

帕金森病(PD)是臨床常見的神經退行性疾病之一，病理基礎為黑質與紋狀體多巴胺能神經元進行性缺失，多巴胺合成受阻，此病發病隱匿，早期診斷相對困難，臨床治療以恢復腦內多巴胺水平、控制病情為目標[1]。研究[2,3]指出，線粒體代謝異常誘發的多巴胺能神經元自噬參與了PD的發生發展，通過外源性的三磷酸腺苷(ATP)干預激活線粒體-ATP-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑，可加劇PD大鼠神經元自噬和神經功能損傷。就傳統中醫學而言，PD屬“震顫麻痹”范疇，病位在腦，屬“本虛標實”之證，本虛指腎虛，標實為內風、瘀血、痰濁所致心神失主。加味五虎追風散出自《晉男史傳恩家傳方》，主要用于祛風止痙，現代藥理學研究發現其在治療PD方面也有積極作用[4,5]。文獻[6,7]報道，加味五虎追風散在保護多巴胺能神經元功能方面有積極作用，但具體機制尚未明確。中藥組方具有多靶點的作用優勢，加味五虎追風散是否能夠作用于線粒體-ATP-mTOR途徑介導的多巴胺能神經元自噬尚不得知。本研究觀察了加味五虎追風散對PD大鼠腦組織多巴胺能神經元自噬活性的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠100只，月齡6～8個月，體質量(200±20)g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(浙)2015-008]。

1.2 藥物、試劑及儀器 加味五虎追風散由廣西中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供(江蘇江陰天江藥業有限公司)，為新型濃縮顆粒劑(蟬蛻6 g、天南星6 g、天麻12 g、全蝎3 g、僵蠶10 g、大地棕根15 g)，每袋含原生藥材9 g；西羅莫司(華北制藥股份有限公司，國藥準字H20050812)，規格：1 mg/片×10片，批號：130521200001W;戊巴比妥鈉、6-羥基多巴胺、阿撲嗎啡(Sigma公司)。線粒體提取試劑盒、ECL試劑盒、BCA試劑盒(上海寶生物)，抗體(Abcam公司)。大鼠立體定向儀(北京友誠嘉業生物科技有限公司，51600)，微量注射泵(深圳瑞沃德生物科技有限公司，KDS310)，垂直電泳和電轉印裝置(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，Mini-Protean)，臺式低速冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司，TDL5M)，切片機(德國萊卡，RM2126)，倒置顯微鏡(德國奧林巴斯，IX83)，透射顯微鏡(德國卡爾蔡司，LIBRA 200)，線粒體呼吸檢測儀(英國漢莎儀器有限公司，Oxytherm)，生物發光檢測儀(北京原平皓生物技術有限公司，TD20/20n)。

1.3 實驗動物分組、PD模型制備及加味五虎追風散給予方法 100只大鼠隨機分為中藥組、西藥組、模型組、對照組各25只。各組大鼠均腦內埋管，即以1%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于立體定向儀，常規皮膚脫毛和消毒后進行開顱手術。采用醫用電鉆鉆開顱骨，將套管埋入大鼠腦內，以螺絲固定不銹鋼套管，位置調整得當后以牙科膠將套管和螺絲一起固定于顱骨。埋管后大鼠自由生存10 d，期間每天肌肉注射青霉素預防感染。埋管的第11 d，模型組、中藥組和西藥組通過微量注射泵予以6-羥基多巴胺溶液[將10 μg的6-羥基多巴胺溶于4 μL生理鹽水中(含0.2%維生素C)]制備PD模型，對照組僅予以4 μL生理鹽水(含0.2%維生素C)，流速均為0.5 μL/min。注射6-羥基多巴胺后休養1 d，第2 d進行模型評價[行為學評價：皮下注射阿撲嗎啡0.05 mg/kg，誘導健側旋轉行為，記錄旋轉圈數，持續30 min，平均轉數>7 r/min者定義為模型制備成功；腦組織病理評價方法：各組隨機取6只大鼠，取中腦組織制備病理切片，免疫組織化學實驗測定黑質DA能神經元標志物內酪氨酸羥化酶(TH)和α-突觸核蛋白(α-syn)表達，以TH表達下調、α-syn表達上調為模型制備成功標準；剔除模型不成功者和死亡者]。制模成功后次日，中藥組大鼠灌胃加味五虎追風散(無菌蒸餾水溶解)，給藥量為1.2 g/kg，1次/d，連續1周；西藥組灌胃西羅莫司(研為末，溶解于無菌蒸餾水)，給藥量為0.27 mg/kg，1次/d，連續1周；對照組和模型組均灌胃等體積無菌蒸餾水。

1.4 大鼠腦組織多巴胺能神經元自噬活性指標Beclin 1、LC3B檢測 各組隨機取大鼠(中藥組7只、西藥組8只、模型組9只、對照組13只)，斷頭取取腦，分離出中腦和紋狀體，采用總蛋白質抽提試劑盒提取蛋白質，采用免疫蛋白印記實驗檢測Beclin 1、LC3B蛋白。主要步驟：①組裝電泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳液，凝膠固定后進行上樣，控制每個上樣通道的樣品蛋白含量為10 μg，先40 V預電泳30 min清除膠內雜質，再90 V電泳1 h，此時不同分子量的蛋白依次分開并排列于膠體中；②組裝電轉印的“三明治”結構進行轉印，將SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白轉印至硝酸纖維素膜，以便抗體孵育；③4%脫脂牛奶封閉60 min，3%的脫脂牛奶配置抗體稀釋液，PBST液清洗后一抗孵育，Beclin 1、LC3B、β-actin抗體濃度分別為1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500，4 ℃過夜；PBST液清洗后二抗孵育，二抗濃度均為1∶2 000，37 ℃、90 min；④ECL試劑盒熒光顯色，顯色良好者暗室顯影，并保留膠片，采用影像學分析軟件Image J分析灰度值。

1.5 大鼠腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR檢測 各組隨機取6只大鼠(用于線粒體活性、ATP合成酶活力檢測)，斷頭取腦，分離出中腦和紋狀體，電動勻漿，用線粒體提取試劑盒提取線粒體。①線粒體活性：采用線粒體呼吸檢測儀檢測state3的呼吸速率、state4的呼吸速率，并計算線粒體呼吸控制比(RCR)，RCR=state3的呼吸速率/state4的呼吸速率，以此評價線粒體活性。②ATP合成酶活力：采用生物發光檢測儀檢測線粒體ATP合成酶活力，檢測方法為熒光素-熒光素酶發光法。

配置5 mL反應體系(0.5 mmol EDTA、10 mmol 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、5 mmol磷酸鹽緩沖液、2.5 mmol MgCl2、0.5 mol蘋果酸、0.25 mol谷氨酸、100 μL熒光素-熒光素酶、50 μg線粒體)，所有試劑現用現配，并以該體系的發光強度作為底物強度。ADP啟動反應，記錄發光強度在不加線粒體和ADP的平行實驗中，加入1 nmol ATP，記錄發光強度，標定ATP合成量。③p-mTOR：所取大鼠及p-mTOR檢測步驟均與“1.4”相同，其中p-mTOR抗體濃度為1∶2 000。

2 結果

2.1 各組腦組織Beclin 1、LC3B蛋白表達比較 結果見表1。

表1 各組腦組織Beclin 1、LC3B蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與西藥組比較，△P<0.05。

2.2 各組腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR表達比較 結果見表2。

表2 各組腦組織線粒體活性、ATP合成酶活力、p-mTOR比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

PD是臨床常見的神經退行性疾病之一，發病率隨年齡的增長而遞增，主要表現為靜止性震顫、運動遲緩和肌肉強直等運動缺陷，部分患者伴有認知功能損害和神經精神功能異常。PD的病理基礎為黑質與紋狀體多巴胺能神經元進行性缺失，多巴胺合成受阻，據悉只有多巴胺能神經元缺失達到50%以上時才會表現出明顯的臨床癥狀，因此PD發病隱匿，早期診斷相對困難。目前，臨床上應對PD的主要策略仍是對癥支持治療，以恢復腦內多巴胺的水平、控制病情為目標。左旋多巴仍是治療PD的最有效藥物，其起效快、療效確切，但也存在較大不良反應，可影響患者的精神狀態，且長期應用藥效減弱。西羅莫司是一種新型大環內酯類免疫抑制劑，目前臨床多用于預防器官排斥和免疫調節，隨著mTOR在神經性疾病中，如癲癇、PD、神經紊亂等介導的重要機制被逐漸揭示，西羅莫司在諸多疾病的基礎研究中取得了進展[8]。動物研究[9]已證實，西羅莫司PD大鼠的多巴胺能神經元具有保護作用。研究者相繼開發了多巴胺受體激動劑(溴隱亭、吡貝地爾、普拉克索)、多巴胺釋放劑(金剛烷胺)和單胺氧化酶B抑制劑(司來吉蘭)等，均有其應用瓶頸，或單獨使用效果差，需佐助左旋多巴，或不良反應大，或適用人群有限[10]。因此，毒副作用小、適用人群廣的新的抗PD藥物仍需要繼續摸索。

五虎追風散出自《晉男史傳恩家傳方》，主要用于祛風止痙，現代藥理學研究發現其在治療PD方面也有積極作用[11,12]。原方五虎追風散由蟬蛻、天南星、天麻、全蝎、僵蠶、朱砂組成，具有祛瘀化痰、熄風止痙的功效，主治破傷風、中風恢復期等神經系統病變。既往臨床研究已證實，五虎追風散在PD、神經痛、各種中風后遺癥及小兒痙癥中均取得了良好的應用效果。也有研究指出，五虎追風散能夠緩解左旋多巴誘發的異動癥，佐助左旋多巴用藥可降低藥物不良反應發生率。我們認為五虎追風散雖重治其標，但對其發病之本不能兼顧，所以在五虎追風散的基礎上去有毒性的朱砂而加入壯藥大地棕根成為加味五虎追風散。方中蟬蛻既能祛外風，又能熄內風，而解痙止顫；天南星苦溫辛烈，善能開泄以祛風解痙，為專治經絡風痰的要藥；全蝎、天麻、僵蠶活血化瘀、平熄內風而止顫；壯藥大地棕根補腎祛風行血，全方配伍精煉全面，標本兼治，共奏補腎活血、化痰通絡熄風之效。

在自噬相關分子中，Beclin 1是形成自噬體的必需分子，也是自噬體成熟的重要標志物[13]。LC3B有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式，靜息狀態下以LC3Ⅰ的形式存在，當自噬啟動后，LC3Ⅰ在自噬相關蛋白ATG7、ATG12等的作用下與磷脂酰乙醇胺共價結合，形成LC3Ⅱ，并結合在自噬體膜上，因此LC3ⅡI/LC3Ⅰ可以作為衡量自噬活性的指標[14]。本研究顯示，與對照組比較，模型組Beclin 1、LC3B蛋白表達升高，說明PD大鼠啟動了細胞自噬作用來緩解黑質神經元和線粒體損傷；與模型組比較，中藥組和西藥組均能夠提高細胞自噬活性，協助機體發揮神經元保護作用；另外本研究還發現，加味五虎追風散對自噬的調控強度不如西羅莫司，但對癲癇病理和線粒體活性的改善效果卻與西羅莫司相仿，說明加味五虎追風散還能夠通過自噬以外的機制來發揮神經元保護作用。

既往有研究證實，線粒體損傷是PD的重要原因，腦組織約占全身體重的2%，耗氧量卻占人體的20%左右。線粒體是細胞能量代謝和活性氧產生的中心，負責機體細胞和組織的ATP供應。PD患者黑質和杏仁核區域存在大量水腫和壞死的線粒體，這些線粒體的堆積導致能量代謝異常和活性氧供應障礙，從而促進了多巴胺能神經元的損傷與死亡。及時清除缺損線粒體是保護黑質多巴胺能神經元和抑制PD病情發展的一條重要途徑，而細胞自噬是真核細胞降解自身老化、受損細胞器，并將其用于重新供能的關鍵生物學行為。mTOR是自噬的一個抑制因子，西羅莫司相當于自噬啟動劑。在缺血缺氧狀態下，mTOR對ATP極為敏感，一旦ATP水平出現較大幅度的下降，mTOR便會受到抑制，引起自噬增強，以滿足機體在應激狀態下的能量和活性氧供應。本研究顯示，與對照組比較，模型組RCR和ATP酶合成能力均降低；與模型組比較，加味五虎追風散和西羅莫司的干預均能夠改善線粒體功能和ATP合成酶活力。

總之，加味五虎追風散能夠通過線粒體-ATP-mTOR途徑促進多巴胺能神經元自噬，發揮神經保護作用，同時也發現加味五虎追風散還能夠通過自噬以外的途徑來發揮神經元保護作用，其藥理機制還具有較大的挖掘空間。