不同劑量甲基阿魏酸灌胃對大鼠酒精性肝病的治療作用及其機制探討

程琪，賀鶴，朱芳嬋，李麗，楊成芳，鐘毓娟，李勇文

(桂林醫(yī)學院，廣西桂林 541000)

長期過度飲酒會導致不同程度的酒精性肝病(ALD)[1]，從酒精性脂肪性肝炎演變?yōu)榫凭灾靖?，最后階段是酒精性肝硬化，是不可逆轉的，有較高的發(fā)病率和病死率[2,3]。ALD發(fā)病機制復雜，主要有酒精攝入過量、遺傳因素、營養(yǎng)不良和氧化應激損傷等原因[4]。氧化應激損傷在ALD的發(fā)展中起至關重要的作用，然而對于氧化損傷的有效治療藥物仍然缺乏[5]。甲基阿魏酸(MFA)是從蟬翼藤中提取的一種單體，蟬翼藤具有較強的抗菌抗炎、抗病毒、免疫增強等功能[6]。本課題組前期研究表明，MFA可抑制乙醇誘導的L-02細胞凋亡和大鼠肝臟脂代謝紊亂[7,8]。本研究采用酒精灌胃法制備ALD大鼠模型，同時給予MFA進行干預，觀察MFA對大鼠ALD的治療作用，并探討其可能機制，旨在為MFA用于治療ALD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性成年SD大鼠60只，體質量180～220 g，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號為SCXK(桂)2016-0050]。將大鼠飼養(yǎng)于SPF級屏障動物房內，房間溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，自由進食進水。

1.2 藥物、試劑及儀器 MFA(美國Sigma公司)。無水乙醇(AR級，汕頭市西隴化工有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒(桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司)；過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒(北京市天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液(強)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強劑,南通市碧云天生物技術研究所)；兔抗B淋巴細胞瘤2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3,上海生工生物工程股份有限公司)；β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。Model 680型酶標儀、T100TM PCR擴增儀和Chemi Doc型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；XL-600全自動生化分析儀(德國Erba公司)。

1.3 實驗動物分組及MFA給予方法 將60只大鼠隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、正常組各12只。低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組大鼠給予酒精灌胃誘發(fā)ALD，酒精劑量先增加后減少，第1～2周為2 g/(kg·d)，第3～4周為4 g/(kg·d)，第5～6周為6 g/(kg·d)，第7～10周為8 g/(kg·d)，然后再減至2 g/(kg·d)；每天灌胃1次，連續(xù)16周。以16周后大鼠血清ALT、AST水平升高為構建ALD模型成功。正常組大鼠只灌胃相同體積的生理鹽水。從第13周開始，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃5、10、20 mg/kg的MFA，模型組和正常組給予等體積的溶媒，1次/d，連續(xù)4周。

1.4 大鼠體質量、肝臟指數測算及肝臟組織病理學檢查 16周末，稱大鼠體質量。稱重后將所有大鼠施行安樂死，收集肝臟組織，磷酸鹽緩沖液沖洗肝臟，用濾紙輕輕拭干并立即稱重，計算肝臟指數，肝臟指數(%)=肝臟質量(mg)/體質量(g)×100%)。各組隨機選取3只大鼠的肝臟組織，固定位置，用中性甲醛溶液固定，經脫水、石蠟包埋、切片(厚5 μm)、脫蠟后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.5 大鼠血清ALT、AST及肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA檢測 每組隨機選取3只大鼠，腹主動脈采血，通過離心(3 000 r/min，4 ℃)20 min獲得大鼠的血清樣品。按照試劑盒說明書，采用生化分析儀檢測血清ALT、AST。另外，每組隨機選取3只大鼠肝臟組織(100 mg)制備肝臟組織勻漿，按照試劑盒方法檢測肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA。

1.6 大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值測算 每組隨機選取3只大鼠，固定位置取肝臟組織100 mg，放入玻璃勻漿器中。加入1 mL RIPA組織裂解液(含有5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL蛋白酶抑制劑)，于冰上充分勻漿，裂解物置于冰上10 min，離心(13 000 r/min，4 ℃)10 min。取上清，BCA法進行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于100 ℃煮沸5 min。12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上，將PVDF膜用5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜。用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶500)、cleaved-Caspase-3(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜除去過量的一抗，用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光法進行發(fā)光，X射線膠片顯影。膠片掃描后測定蛋白灰度值。以β-actin為內參，計算目標蛋白相對表達量以及Bax蛋白/Bcl-2蛋白、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值。

1.7 大鼠肝臟組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相對表達量比值測算 每組隨機選取3只大鼠，固定位置取肝臟組織100 mg，按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)Simple Total RNA kit說明書提取肝臟總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度，OD260/OD280在1.8～2.0。并按照逆轉錄試劑盒Fast Quant RT kit(with gDNase)說明書逆轉錄得cDNA。查找基因序列并設計引物，Bax引物序列：5′-agacaggggcctttttgctac-3′，5′-aattcgccggagacactcg-3′；Bcl-2引物序列：5′-ggtggggtcatgtgtgtgg-3′，5′-gggttcaggtactcagtcatcc-3′；β-actin引物序列：5′-tgttaccaactgggacgaca-3′，5′-ggggtgttgaaggtctcaaa-3′。然后再進行PCR擴增，PCR反應總體積為25 L，熱循環(huán)條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)后于72 ℃延伸10 min。反應結束后分別取10 L擴增產物和5 L DNA Marker上樣，進行2%瓊脂糖凝膠電泳。Bio-Rad自動凝膠成像分析系統(tǒng)檢測OD值，Quantity One軟件進行分析，以β-actin為參照物。計算Bax mRNA/Bcl-2 mRNA相對表達量比值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、肝重、肝臟指數比較 結果見表1。

表1 各組大鼠體質量、肝重、肝臟指數比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學比較 ①肉眼觀：正常組大鼠肝臟呈紅褐色，包膜光滑，邊緣銳利，質地適中；模型組大鼠肝臟顏色泛白，體積增大，包膜緊張，切面油膩，邊緣變鈍；低、中、高劑量組介于正常與模型組之間，其中高劑量組肝臟外觀接近正常組。②光鏡下：正常組大鼠肝臟結構形態(tài)正常，無明顯病變；模型組中央靜脈擴張，肝竇擴張，肝細胞排列紊亂，顯著腫大，邊界模糊，胞質中充滿脂肪泡，出現明顯脂肪變性，同時可見炎性細胞浸潤、變性、壞死等現象；中、高劑量組大鼠肝臟損傷程度有明顯改善，大鼠肝細胞變性和壞死程度明顯減輕。

2.3 各組大鼠血清ALT、AST水平比較 結果見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠肝臟組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA表達比較 結果見表3。

表3 各組大鼠肝臟組織SOD、GSH-Px、MDA、CAT表達比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

2.5 各組大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白相對表達量比值比較 結果見表4。

3 討論

ALD是臨床上常見的肝臟疾病，主要是由于長時間大量飲酒所引發(fā)的肝臟損害性病變。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對人們的身體健康造成嚴重危害。目前，ALD的治療尚缺乏有效的方法[9,10]，主要采取戒酒、補充營養(yǎng)及美他多辛、水飛薊賓類、S-腺苷甲硫氨酸等藥物治療[11]，治療方法非常局限，往往達不到預期效果。因此，尋找能有效治療ALD且不良反應小的新藥尤為迫切。中草藥在預防和治療ALD方面表現出多靶點、低毒性、療效較為確切的優(yōu)勢，顯示出了良好的前景[12]。MFA是從中草藥蟬翼藤的根莖中提取純化后得到的一種單體[6]，我們前期研究發(fā)現其可以抑制乙醇和CCl4誘導的大鼠肝纖維化，且無明顯不良反應[13,14]。酒的主要成分是乙醇，長期酗酒，乙醇及其代謝產物會導致肝損傷。眾所周知，血清轉氨酶是肝損傷的敏感標志。Sun等[15]研究表明，乙醇可以誘導酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平升高。本研究顯示，ALD大鼠體質量明顯減輕而肝重顯著增加，因此肝臟指數增大；MFA干預后可以顯著抑制ALD大鼠肝臟指數增大。此外，ALD大鼠肝臟組織出現嚴重的病理改變，并且血清中ALT和AST水平顯著升高；MFA干預后可以改善肝臟酒精性病理改變，且隨著劑量增加，ALD大鼠血清中ALT、AST水平明顯降低，說明MFA具有抗ALD的作用。

表4 各組大鼠肝臟組織Bax蛋白/Bcl-2蛋白、Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、cleaved-Caspase-3蛋白/Caspase-3蛋白

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與高劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，▲P<0.05。

乙醇攝入過多會在肝內代謝產生活性氧(ROS)，肝臟內過量的ROS介導肝臟脂質代謝紊亂以及肝細胞脂質過氧化，使肝細胞膜穩(wěn)定性變差，炎癥因子釋放增多，肝細胞凋亡增加，最終導致ALD[16]。體內脂質過氧化產生大量MDA，與氧化應激反應密切相關。此外，長期酗酒導致肝臟中抗氧化因子如SOD、GSH-Px和CAT等酶類大量消耗，使得肝臟清除ROS能力下降，體內氧化還原平衡被打破，引發(fā)氧化應激反應[17]。本研究顯示，MFA可顯著提高ALD大鼠肝臟中SOD、GSH-Px和CAT含量，并明顯降低MDA含量，起到對抗乙醇誘導的氧化應激損傷的作用，且呈劑量依賴式。

Bcl-2家族和Caspase家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2家族中Bax發(fā)揮促凋亡作用，相反Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，二者共同決定細胞生死[18]。Caspase-3是Caspase家族的成員之一，也是細胞凋亡的中心效應因子。酒精引起肝臟氧化應激反應也可通過調控細胞凋亡相關因子Bcl-2和Bax的表達，進而活化Caspase-3，誘導肝細胞凋亡[19]。本研究顯示，MFA可抑制乙醇誘導的ALD大鼠肝臟中Bax/Bcl-2蛋白、mRNA表達比值，抑制cleaved-Caspase3/Caspase-3蛋白表達比值，從而抑制細胞凋亡，發(fā)揮抗ALD作用。

總之，MFA對大鼠ALD有治療作用，且高劑量效果更佳，其機制可能為減輕ALD發(fā)病關鍵環(huán)節(jié)氧化應激及細胞凋亡程度。