明目消朦預處理對H2O2誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡及氧化應激損傷的影響

袁靈梅，賈洪亮，王燕，袁遠，尚亞南，曾志奎，邱波

(1江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006；2廣東省中醫院；3解放軍第一五二中心醫院)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發癥之一，隨著DM患者人數的快速增長和人口老齡化的加劇，其發病率逐步增加。DR是視網膜微血管長期累積損傷的結果，氧化應激是DR發病機制中的重要因素之一。研究表明，明目消朦(MMXM)對DR有效，包括單純期及增殖期DR。前期研究[1]表明，MMXM可抑制DM大鼠體內的自由基毒素，改善體內氧化-抗氧化平衡狀態，減少視網膜新生血管形成，而其對DR氧化應激的影響有待進一步探討。本研究通過H2O2制備人視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)氧化應激損傷模型，探討MMXM對RPE細胞凋亡及氧化應激損傷的影響，旨在為MMXM治療DR的功能性作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 MMXM(廣東省中醫院)，將2片(0.5 g/片)MMXM加入5 mL基礎培養基中充分溶解，用0.22 μm過濾器過濾除菌，將配置好的MMXM母液(200 mg/mL)放入4 ℃保存備用。DMEM(美國Hyelon公司)，新生牛血清(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，鏈霉素(廣州威佳科技有限公司)，青霉素(哈藥集團制藥廠)，DMSO(廣州威佳科技有限公司)，30%過氧化氫(廣州化學試劑廠)，Muse Multicaspase Kit(Millipore)，Muse Oxidative stress Kit(Millipore)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成)，其他分析純試劑(廣州化學試劑廠)。臺式高速冷凍離心機(Heal Force)，純水儀(青島富勒姆科技)，流式細胞儀(Milipore)，渦旋混合器(Servicebio)，全自動研磨儀(武漢康濤科技有限公司)，酶標檢測儀(Rayto)，0.22 μm過濾器(廣州威佳科技有限公司)。

1.2 RPE細胞培養 獲取凍存的RPE細胞，實驗前對細胞進行復蘇。將恒溫水浴缸預熱至37 ℃，從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37 ℃水浴中不斷輕搖凍存管使其完全融化。用75%酒精噴拭凍存管表面，轉入無菌操作臺內用移液槍向凍存管內加入完全培養基500 μL，500 r/min離心5 min。吸除上清液后加入完全培養基1 mL吹打重懸細胞。向準備的培養皿內加入完全培養基(細胞培養基為含10%血清，鏈霉素100 μg/ mL，青霉素100 U/ mL的DMEM)，用移液槍將細胞懸液移入培養皿。將細胞培養皿放入5%CO2、37 ℃培養箱中培養。第2天細胞換液，之后2～3 d換液1次，待細胞生長至80%～90%時進行細胞傳代。

1.3 RPE細胞分組及MMXM應用方法 取對數生長的細胞，按2×105/mL密度接種于含完全培養基的6 cm培養皿中，24 h細胞貼壁后，吸除舊培養基，更換無血清的基礎培養基。將細胞分為4組，A組加入含MMXM的無血清培養基，MMXM的終濃度為0.5 mg/mL，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2(以制備氧化應激損傷模型)；B組加入無血清的基礎培養基，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2；C組加入含MMXM的無血清培養基，MMXM的終濃度為0.5 mg/mL；D組加入無血清的基礎培養基；4組細胞處理保持同步。24 h后同時取出4組細胞，常規胰酶消化離心細胞，得到各組細胞沉淀。

1.4 RPE細胞凋亡率測算 預先按說明書配制好調亡試劑(Multicaspase Reagent)。將Caspase Buffer 10×(100 μL)加900 μL的ddH2O稀釋至1×(1 000 μL)。細胞常規消化收集加入1×PBS 100 μL重懸細胞。將準備好的4個1.5 mL離心管內分別加入1×Caspase Buffer 50 μL和Multicaspase Reagent 5 μL后混勻。上述混勻液加入10 μL細胞懸液混勻。1.5 mL離心管避光條件下置于37 ℃孵育30 min。剩余的1×Caspase Buffer加入7-AAD原液5 μL配制成7-AAD工作液。離心管從37 ℃培養箱取出，在避光條件下各加入7-AAD工作液150 μL，避光室溫孵育5 min。用流式細胞儀檢測各組細胞調亡的結果，以調亡率來表示。

1.5 RPE細胞氧化應激損傷指標檢測 ①ROS檢測:預先按說明書配制好Oxidative stress工作液。細胞常規消化收集加入1×PBS 100 μL重懸細胞。取上述細胞懸液10 μL加入190 μL Oxidative stress工作液混勻。避光條件下置于37 ℃孵育30 min。用流式細胞儀檢測ROS結果。②MDA檢測：準備4個離心管，標準管、空白管分別加入a*標準品、無水乙醇，測定管、對照管加入a*樣本，4個管同時加入a*的試劑一(a*表示所取的樣本量、無水乙醇、標準品量、試劑一的量，四者均相等)，標準管、空白管、測定管再加入3 mL試劑二和1 mL試劑三,對照管加入3 mL試劑二和1 mL 50%冰醋酸。加樣完成后用旋渦混勻器混勻，用保鮮薄膜將試管口扎緊，針頭在保鮮薄膜上刺一個小孔，95 ℃沸水反應40 min，取出后用流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10 min(3 000 r/min以下離心時間需延長，目的使沉淀完全)。取上清，532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測各管吸光度值。MDA含量(nmol/mg protein)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標品濃度(10 nmol/mL)/樣品蛋白濃度(mg protein/mL)。③SOD檢測： 測定管和對照管各加入1 mL試劑一后分別加等量的樣品和蒸餾水，再加入0.1 mL試劑二、三、四，然后用旋渦混勻器充分混勻，37 ℃恒溫水浴40 min后加入2 mL顯色劑。混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，比色。SOD活力(U/mg protein)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值×0.5×反應體系稀釋倍數/待測樣本蛋白濃度(mg protein/mL)。④GSH-PX檢測：測定管和對照管按說明書流程加入試劑一、試劑二及樣品，混勻，3 500～4 000 r/min，離心10 min，取上清1 mL。空白管加GSH標準品溶劑1 mL，標準管加20 μmol/L GSH標準液的1 mL，4個離心管同時加入試劑三、四、五，混勻，室溫靜置15 min后，412 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調零，測各管OD值。GSH-PX活力=(非酶管OD值-酶管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(5)/反應時間/(取樣量×蛋白濃度)。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 A、B、C、D組細胞凋亡率分別為17.83%±1.71%、46.02%±2.34%、6.65%±0.88%、6.27%±0.97%，B組與其余3組比較，A、B組與C、D組比較，P均<0.05。

2.2 各組細胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比較 結果見表1。

表1 各組細胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比較

注：與D組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

3 討論

DM是一種影響全身各個臟器和組織血管糖代謝紊亂的內分泌性疾病。DR是DM的嚴重并發癥，為工作年齡段成人新發失明的主要原因。微血管瘤、淺層或深層出血、硬性滲出、棉絨斑、靜脈串珠樣、黃斑水腫等是DR的病變特點，后期隨著新生血管的出現，DR進入增殖期。RPE細胞是視網膜光感受器的調節中起重要作用的視網膜細胞層，其在運輸和儲存材料中起作用，例如吞噬分離的感光細胞外節，遮光，去除自由基，合成細胞因子，并形成血-視網膜屏障。故我們應用DR發展過程中發揮重要作用的RPE細胞[2～5]開展實驗研究，并通過H2O2誘導細胞建立氧化應激模型。

DR治療相當棘手，有效治療輕中度非增殖期DR的藥物尚少，而且適用于高危非增殖期及增殖期糖尿病視網膜患者的激光光凝可能損傷視網膜，抗VEGF治療費用昂貴，且部分患者存在無應答的情況。因此，找尋有效、價格適中且不良反應少的治療方法是亟待解決的問題。中醫藥治療DR的研究取得了一定進展，不少研究結果證明DR應用中醫藥治療具有良好的前景[6～9]。MMXM主要由蒺藜、五味子、密蒙花等中藥組成。蒺藜含有類固醇、皂甙、類黃酮等天然動態物質，蒺藜提取物具有抗氧化和清除自由基的特性；類黃酮是一種抗氧化劑，可以降低ROS[10]。文獻[11,12]報道，五味子亦具有強大的抗氧化功效。中醫學認為，DR以氣陰兩虛為本虛，瘀血阻絡為標實。故中醫治療DR多從益氣養陰補其虛，活血通絡、化痰散瘀治其標。MMXM具有益氣養陰、活血化瘀、化痰、明目的功能。方中補瀉兼施，寒溫并用，補中有瀉，寒中有熱。全方合用諸藥，既能針對DM的陰虛之本，又能兼顧早期的氣陰兩虛之特點既能針對瘀血、痰濕等實證之標，又能涼血止血而不留瘀血、化痰散結不傷正。MMXM在治療眼底病方面能改善視網膜微循環障礙，改善視網膜的缺血缺氧狀態，從而促進視網膜滲出、出血的吸收，對改善氣陰兩虛、痰瘀互結的中醫證候療效滿意。

氧化應激是DR的重要機制，可直接導致DM視網膜細胞功能障礙或細胞凋亡[13～15]。氧化應激可能由于代謝應激的持續循環，組織損傷和細胞死亡而被放大，導致自由基產生增加并且損害了自由基抑制性清除劑系統，而這又進一步加劇了氧化應激。研究指出，DM并發癥的所有機制似乎都與活性ROS過量產生有關[16]。ROS與脂質的特定反應通常稱為“脂質過氧化”，脂質過氧化過程的主要產物是MDA[17,18]。本研究顯示，與B組比較，其余3組細胞凋亡率降低；與C、D組比較，A、B組細胞凋亡率升高。與D組比較，A、B組ROS(+)、MDA升高，ROS(-)降低；與B組比較，其余3組ROS(-)升高，ROS(+)、MDA降低。人體自身配備了一個高效的抗氧化防御系統，其中包括多種抗氧化酶，抗氧化物被認為是檢測自由基并防止它們對其他細胞造成損害的第一道防線[19]。SOD是一種內源性的抗氧化劑，幾乎所有的細胞中都存在SOD。GSH是一種胞內抗氧化劑，在細胞中重要的防御,它可以充當ROS清除劑和調節細胞內氧化還原狀態[20]。GSH-PX在DM患者中喪失其活性和抗原性，谷胱甘肽氧化還原反應，生物合成和降解受到影響。本研究顯示，與D組比較，A、B組SOD、GSH-PX降低；與B組比較，其余3組SOD、GSH-PX升高。當抗氧化酶和抗氧化物消耗時，氧化應激導致細胞損傷[21]。

總之，MMXM能有效減少H2O2介導的RPE細胞凋亡，并可預防細胞氧化損傷。