動態對比增強磁共振成像在腦膠質瘤患者瘤細胞增殖定量評估中的應用

賈中正，蔣佳珅，沈丹丹，花燁，葛敏，周學軍

(南通大學附屬醫院，江蘇南通 226001)

細胞增殖是腦膠質瘤的基本特征之一,評估細胞增殖已經成為預測膠質瘤預后的重要因素[1]。隨著分子生物學的發展，分子標記物逐漸應用于膠質瘤細胞增殖的研究。Ki-67抗原是存在于增殖細胞核中的一種核蛋白，與細胞增殖密切相關；而且膠質瘤的Ki-67增殖指數已經被證明有助于膠質瘤的分級診斷與預后評價[2,3]。然而，Ki-67增殖指數需要在手術或穿刺取得腫瘤標本后進行免疫組化測算，這不僅會造成一定的損傷，而且還可能存在抽樣誤差。動態對比增強磁共振成像(DCE-MRI)作為一種無創的功能MRI技術，可以在術前對腦膠質瘤患者進行檢查，而且已被證實可以用于評估膠質瘤分級與預后[4,5]。由于DCE-MRI、Ki-67增殖指數均有助于評估膠質瘤分級與預后，所以我們分析DCE-MRI有可能無創地評估膠質瘤Ki-67增殖指數，目前相關研究鮮有報道。本研究的目的是通過對膠質瘤DCE-MRI參數與Ki-67增殖指數進行對照分析，探討DCE-MRI定量評估腦膠質瘤細胞增殖程度的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2017年12月南通大學附屬醫院收治的腦膠質瘤患者79例，男48例，女31例；年齡14～70歲，中位年齡45歲；根據2007版世界衛生組織(WHO)膠質瘤分級標準[6]，其中Ⅱ級30例[低級別膠質瘤(LGG)]和Ⅲ級8例、Ⅳ級41例[高級別膠質瘤(HGG)]。所有患者術前均未接受任何治療，且均經手術病理證實。本研究經醫學倫理委員會批準，所有患者均簽字同意。

1.2 DCE-MRI指標檢測方法 對每名患者在術前進行常規MRI和DCE-MRI檢查。成像應用3.0T MR掃描儀(GE Healthcare，Milwaukee，Wisconsin)，線圈使用16通道相控陣頭顱線圈。常規MRI掃描包括橫斷面快速自旋回波(FSE)T2WI(TR/TE 3 900 ms/118 ms)、自旋回波(SE)T1WI(TR/TE 1 700 ms/24 ms)、液體衰減恢復序列(FLAIR)(TR/TE 8 000 ms/170 ms)，FOV 240 mm×240 mm，矩陣256×256。掃描范圍從顱底到顱頂，層厚6 mm，間隔2 mm。橫斷面常規MRI增強掃描在DCE-MRI掃描結束后進行。常規MRI的主要目的是用于初步診斷膠質瘤以及臨床手術需要。DCE-MRI掃描：首先，橫斷面掃描5組T1-fast field echo(T1-FFE；RF-spoiled gradient echo)多翻轉角序列，翻轉角：3、6、9、12、15，掃描參數：TR 4.3 ms；TE 1.4 ms；層厚 2.8 mm，層間距1.4 mm；矩陣256×210；FOV 250 mm 250 mm。其次，在多翻轉角序列第5次采集結束后進行DCE序列掃描，經肘靜脈注入對比劑(Gd-DTPA-BMA，Ommiscan，GE Healthcare，Oslo，Norway)，速率為4 mL/s，總量為0.1 mmol/kg[7]，在對比劑注入結束后以相同速率注入生理鹽水10 mL沖洗，掃描翻轉角12 ，其余參數同多翻轉角掃描序列。單次掃描時間7 s，共60期，DCE掃描總時間7 min。將多翻轉角序列及DCE序列所有數據傳入后處理軟件模塊(OmniKinetics，GE Healthcare，China)，選擇上矢狀竇作為標記血管。在該軟件中選擇改良的Tofts-Kermode模型，通過運算獲得容積轉運常數(Ktrans)、血管外細胞外間隙容積比(Ve)[8]。兩位經驗豐富的神經放射醫師在Ktrans與Ve圖的腫瘤最高信號區域手動設置感興趣區(ROI)，ROI大小為20～40 mm2，每例膠質瘤測量3次，選取最大的Ktrans與Ve。ROI設置時應避免出血、壞死與正常腦血管。

1.3 Ki-67增殖指數測算方法 免疫組化采用Dako EnVision法，一抗采用Ki-67(鼠單克隆抗體，1∶100，Abcam)。所有的膠質瘤標本均通過臨床手術獲取。每例標本先通過4%甲醛固定，然后石蠟包埋，切取4 μm厚切片。切片后經過脫蠟、水化、抗原修復，然后進行染色。染色之后，先于低倍鏡(40×)下找出Ki-67抗原標記密度“熱區”，棕褐色為Ki-67抗原染色陽性。在高倍鏡下采用CCD隨機抽取5個視野的照片，采用Motic圖像分析系統(version3.2,Motic China GroupCO. Ltd.)計算陽性著色面積占圖像總面積的百分比，增殖指數計數=Ki-67陽性細胞/細胞總數×100%，選取最大值。

2 結果

2.1 不同級別膠質瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指數比較 結果見表1。

表1 不同級別膠質瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指數比較

注：與HGG比較，*P<0.05。

2.2 不同級別膠質瘤Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數的相關性 結果見圖1，由圖1可知，HGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數均呈正相關(r分別為0.614、0.644，P均<0.05)，LGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數均無相關性(P均>0.05)。

3 討論

膠質瘤是成人最常見的原發腦內腫瘤，致殘率、致死率、復發率均比較高，嚴重影響患者生命與生活質量。根據WHO腦腫瘤分級標準，膠質瘤分為低級別(Ⅰ級、Ⅱ級)與高級別(Ⅲ級、Ⅳ級)，級別越高，惡性度越高。膠質母細胞瘤是最常見的膠質瘤，其腫瘤細胞增殖明顯，且具有高度侵襲性、惡性程度最高的特點[9,10]。盡管治療方法在不斷取得進步，但目前膠質瘤的總體預后仍較差[11]。

注：圖A、B顯示HGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數呈正相關，圖C、D顯示LGG的Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數均無相關性。

圖1不同級別膠質瘤Ktrans、Ve與Ki-67增殖指數的相關性分析

膠質瘤細胞增殖是其生物學行為的主要特征，細胞增殖指數是定量評估膠質瘤生長及預后的重要標記物[12]。Ki-67增殖指數已被認為與膠質瘤細胞增殖密切相關，并且與膠質瘤的鑒別診斷與預后明顯相關[13～16]。本研究顯示，HGG的Ki-67增殖指數大于LGG，說明HGG具有更明顯的腫瘤細胞增殖程度，與前期研究[17]結果一致。但是測量膠質瘤Ki-67增殖指數需要手術或定向穿刺獲取腫瘤標本，然后再進行免疫組織化學檢測，這不但有可能受到腫瘤發生部位或患者身體一般狀況的限制，而且也有可能由于切除不全或腫瘤異質性而造成抽樣誤差。因此，無創性的細胞增殖檢測技術對于診斷和治療膠質瘤變得尤為重要。

MRI技術作為一種無創的檢測手段，已經廣泛應用于膠質瘤的診斷與鑒別診斷。DCE-MRI作為近些年新出現的功能MRI技術，已經用于膠質瘤的研究。DCE-MRI主要成像原理是利用順磁性對比劑注入血管導致T1時間縮短的特性[18～20]，然后應用動態連續成像記錄對比劑隨時間在組織中的分布情況。DCE-MRI的兩個主要參數Ktrans與Ve主要反映對比劑分子通過血管壁的能力，即血管的通透性，借此評估腫瘤血管的破壞程度，從而間接評價腫瘤的惡性程度。到目前為止，有關DCE-MRI的膠質瘤研究絕大多數都集中于微血管生成與通透性或灌注[7,21～24]，而DCE-MRI有關膠質瘤細胞增殖的研究很少。本研究顯示，HGG的Ktrans、Ve均大于LGG，提示膠質瘤隨著惡性程度的增高，腫瘤細胞增殖更加明顯，同時伴隨著腫瘤微血管的通透性增加，分析原因可能是因為在HGG中腫瘤細胞增殖明顯，而現有的微血管不能滿足腫瘤生長需要[25]。因此，HGG需要額外新生成血管提供更多的營養支持與合適的微環境來滿足腫瘤細胞增殖。這些新生成的微血管分泌血管內皮生長因子(VEGF)，而VEGF可以進一步促使新血管生成而增加微血管滲漏[26]。由于膠質瘤持續生長需要大量消耗氧，所以腫瘤逐漸出現缺氧，而缺氧又可以通過調節VEGF促進新血管生成[27]。因此細胞增殖與新血管生成在膠質瘤生長過程中交替出現。膠質瘤新生成的微血管通常是不成熟而且功能低下，容易引起微血管通透性增高及血腦屏障(BBB)破壞而造成微血管滲漏[28,29]。HGG在腫瘤細胞快速增殖的同時，新生微血管通透性增高與BBB的破壞均有助于Ktrans與Ve的升高。相反，在LGG中，由于細胞增殖不明顯，所以現有的微血管通過擴張基本能夠滿足腫瘤生長所需要的營養與血氧。由于LGG新生微血管很少，所以BBB比較完整，微血管滲漏也不明顯，Ktrans與Ve無明顯升高。因此，在LGG中，Ktrans與Ve不能反映腫瘤細胞的增殖程度。國內有學者對20例膠質瘤進行DCE-MRI檢查發現，Ktrans與Ki-67增殖指數呈正相關[30]。但我們的研究顯示，在HGG中Ktrans與Ki-67增殖指數呈正相關，而在LGG中并無相關性。

總之，通過DCE-MRI獲得的Ktrans與Ve不僅可以無創地鑒別膠質瘤的分級診斷，而且更有助于評估HGG的細胞增殖程度，能夠為膠質瘤的臨床診療提供重要的參考價值。本次研究還存在一定的局限性。首先由于本次研究屬于回顧性分析，所以不能做病理與影像的點對點對照，不能排除抽樣誤差的可能性，所以我們選擇測量膠質瘤Ktrans與Ve最大值與Ki-67增殖指數最大值進行對照研究以最大程度減小誤差。其次，樣本量相對較小，尤其是僅有8例Ⅲ級膠質瘤。因此，未來還需要繼續擴大樣本量及精準測量對我們的結果進行驗證。