組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞株MDR1、MRP1表達(dá)的影響及其機(jī)制

石斌，王昊，趙亮，馮曉俊

(安徽省立醫(yī)院，合肥 230001)

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤之一，化療是治療肺癌的主要方法，而多藥耐藥性的產(chǎn)生是肺癌化療治療過(guò)程中的最大障礙[1,2]。ATP結(jié)合盒(ABC)外排蛋白家族在多藥耐藥的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用，其中多藥耐藥基因1(MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)與化療耐藥性的關(guān)系更為重要，分別由ATP結(jié)合盒超級(jí)家庭B成員1和ATP結(jié)合盒超級(jí)家庭C成員1編碼[3～7]，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，并與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[3～12]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑是一類新型的強(qiáng)效抗腫瘤藥物，包括伏瑞斯特(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)等，其通過(guò)促進(jìn)腫瘤分化、凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制血管形成等達(dá)到抗腫瘤的目的，在多種腫瘤細(xì)胞中展示出了強(qiáng)力的抗腫瘤效應(yīng)[13～15]。本研究觀察了SAHA和TSA對(duì)肺癌細(xì)胞中MDR1、MRP1表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SAHA和TSA購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；抗體MDR1和GAPDH購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；抗體MRP1購(gòu)自Bioworld公司；抗體蛋白去乙酰化酶1、2、3、4(HDAC1、2、3、4)購(gòu)自華安生物公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞A549和SK-mes-1購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天用0.25%的胰酶消化傳代。

1.3 肺癌細(xì)胞存活力檢測(cè) 采用CCK8法。A549、SK-mes-1細(xì)胞以每孔7×103/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)后，用SAHA(0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)和TSA(0、50、100、200、400、800 nmol/L)處理24 h，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，設(shè)立空白對(duì)照組。加藥處理后每孔加10 μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用450波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 肺癌細(xì)胞MDR1和MPR1基因檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。分別用0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA處理A549細(xì)胞、SK-mes-1細(xì)胞24 h，按照TRIzol說(shuō)明書方法提取兩個(gè)細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列為：MDR1正義鏈：5′-TGCTCAGACAGGATGTGAGTTG-3′；反義鏈：5′-AATTACAGCAAGCCTGGAACC-3′；MRP1正義鏈：5′- GCCAAGAAGGAGGAGACC -3′；反義鏈：5′- AGGAAGATGCTGAGGAAGG-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算MDR1和MPR1基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，取平均值。

1.5 肺癌細(xì)胞MDR1、MPR1蛋白和HDAC1、-2、-3、4及2MeH3K9蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。分別用0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA處理A549、SK-mes-1細(xì)胞24 h，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，用蛋白裂解液裂解，離心后收集上清；等量蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉液室溫孵育2 h，MDR1、MPR1及HDAC1、2、3、4和2MeH3K9抗體均以1∶1 000孵育過(guò)夜，經(jīng)PBST洗滌后，加入二抗以1∶5 000室溫孵育1.5 h，PBST洗滌3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在自動(dòng)曝光儀中曝光，以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件對(duì)每個(gè)蛋白條帶的灰度進(jìn)行分析，計(jì)算MDR1、MPR1、HDAC1、2、3, 、4和2MeH3K9的相對(duì)表達(dá)值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞存活力比較 結(jié)果見表1，由表1可知，0.5 μmol/L的SAHA和100 nmol/L的TSA對(duì)A549細(xì)胞和SK-mes-1細(xì)胞的存活力沒(méi)有明顯影響，因此我們挑選這個(gè)濃度進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度SAHA、TSA作用于肺癌細(xì)胞后OD值比較

2.2 肺癌細(xì)胞中MDR1表達(dá)比較 DMSO處理的A549、SK-mes-1細(xì)胞中MDR1基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.09、1±0.08，SAHA處理的分別為32.25±2.56、8.18±0.82，TSA處理的分別為37.86±3.58、7.85±0.68，與DMSO比較，SAHA、TSA處理后MDR1基因表達(dá)增高(P均<0.05)。DMSO處理的A549、SK-mes-1細(xì)胞中MDR1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.03、1±0.04，SAHA處理的分別為2.75±0.16、3.42±0.25，TSA處理的分別為3.16±0.23、2.13±0.21，與DMSO比較，SAHA、TSA處理后MDR1蛋白的表達(dá)增高(P均<0.05)。說(shuō)明SAHA及TSA可以明顯增加A549、SK-mes-1細(xì)胞中MDR1的基因和蛋白表達(dá)。

2.3 肺癌細(xì)胞中MRP1表達(dá)比較 DMSO處理的A549、SK-mes-1細(xì)胞中MRP1基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.03、1±0.05，SAHA處理的分別為0.56±0.09、0.61±0.08，TSA處理的分別為0.47±0.08、0.54±0.07，與DMSO比較，SAHA、TSA處理后MRP1基因表達(dá)減少(P均<0.05)。DMSO處理的A549、SK-mes-1細(xì)胞中MRP1基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.06、1±0.08，SAHA處理的分別為0.32±0.05、0.45±0.07，TSA處理的分別為0.21±0.06、0.58±0.07，與DMSO比較，SAHA、TSA處理后MRP1蛋白表達(dá)減少(P均<0.05)。說(shuō)明SAHA和TSA可以明顯減少A549細(xì)胞和SK-mes-1細(xì)胞中MRP1的基因和蛋白表達(dá)情況。

2.4 肺癌細(xì)胞中組蛋白乙酰化和甲基化的比較 DMSO處理的HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4及2MeH3K9相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.05、1±0.06、1.0±0.04、1±0.06、1±0.03，SAHA處理的分別為0.96±0.11、0.92±0.08、0.35±0.07、0.32±0.09、3.67±0.21，TSA處理的分別為0.96±0.08、0.95±0.08、0.22±0.03、0.09±0.02、2.35±0.15，與DMSO比較，SAHA、TSA處理后HDAC3、HDAC4蛋白表達(dá)減少，2MeH3K9蛋白表達(dá)增多(P均<0.05)。說(shuō)明HDAC3、HDAC4和2MeH3K9可能在組蛋白去乙酰化酶抑制劑引起肺癌細(xì)胞中MDR1上調(diào)和MRP1下調(diào)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)危害較大的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)一直處于較高的狀態(tài)，化療是治療肺癌的重要方法。順鉑是肺癌化療的首選藥物，順鉑與腫瘤細(xì)胞中DNA交叉連接，形成復(fù)合物，阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，最終引起腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。晚期肺癌的5年生存率較差，主要原因是化療耐藥性的產(chǎn)生。肺癌患者經(jīng)過(guò)初期化療后，腫瘤進(jìn)程得到控制，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的持續(xù)給藥治療后，就會(huì)對(duì)化療藥物的敏感性降低，獲得耐藥性，最終達(dá)不到預(yù)期治療效果，耐藥性的產(chǎn)生最終導(dǎo)致了肺癌的治療失敗。

組蛋白去乙酰化酶是機(jī)體內(nèi)調(diào)控組蛋白乙酰化狀態(tài)的關(guān)鍵酶，作用是抑制組蛋白乙酰化，緊致核小體的結(jié)構(gòu)，抑制基因轉(zhuǎn)錄。在腫瘤組織中，由于組蛋白去乙酰化酶的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了抑癌基因的表達(dá)受到了抑制，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。組蛋白去乙酰化酶抑制劑是一類新型的強(qiáng)效抗腫瘤藥物，主要通過(guò)促進(jìn)組蛋白乙酰化，激活抑癌基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。SAHA是第一個(gè)被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，目前已經(jīng)用于乳腺癌、白血病以及結(jié)直腸癌等的治療[17,18]。TSA是鏈霉素代謝產(chǎn)物，也是第一個(gè)來(lái)源于天然產(chǎn)物的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可特異性抑制哺乳動(dòng)物組蛋白去乙酰化酶，使組蛋白高乙酰化，激活基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞分化或凋亡，與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物比較有明顯的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，對(duì)多種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤具有顯著抑制作用[19～21]，因而被認(rèn)為是一種非常有前景的新型抗腫瘤藥物。

化療耐藥性的產(chǎn)生是制約化療療效的關(guān)鍵因素，ABC外排蛋白的過(guò)度表達(dá)是形成化療耐藥的主要原因。MDR1是研究最為廣泛的ABC外排蛋白，它的作用底物包括天然毒素、抗腫瘤藥物以及它們的代謝產(chǎn)物，MRP1的作用底物是許多有毒化合物的谷胱甘肽結(jié)合物，MDR1和MRP1這兩個(gè)重要的ABC外排蛋白在ATP能量代謝的作用下，將結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，減少了藥物的有效殺傷濃度，從而導(dǎo)致多藥耐藥的產(chǎn)生。MDR1和MRP1涉及了各種化療藥物所引起的化療耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制。雖然組蛋白去乙酰化酶抑制劑是新型的一類強(qiáng)效抗腫瘤藥物，但化療耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)普遍問(wèn)題，組蛋白去乙酰化酶抑制劑也不例外。曾有研究[22～24]報(bào)道，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以增加不同細(xì)胞中的MDR1表達(dá)。另外有一些研究[22,25]發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)不同細(xì)胞中的MRP表達(dá)也有影響。本研究顯示，SAHA和TSA可以增加肺癌細(xì)胞中MDR1表達(dá)，卻抑制MRP1表達(dá)，因?yàn)镸DR1和MRP1作用底物不同，可以將不同的藥物外排出體外，組蛋白去乙酰化酶抑制劑增加了MDR1表達(dá)而減少了MRP1的表達(dá)，當(dāng)組蛋白去乙酰化酶抑制劑和MDR1的作用底物藥物共同用藥時(shí)，可能會(huì)引起多藥耐藥現(xiàn)象，反之當(dāng)組蛋白去乙酰化酶抑制劑和MRP1的作用底物藥物共同用藥時(shí)可以有效抑制多藥耐藥產(chǎn)生。

組蛋白的乙酰化和甲基化在蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，組蛋白去乙酰化酶可以通過(guò)抑制組蛋白乙酰化，抑制基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。常見的組蛋白乙酰化酶包括HDAC1、2、3、4，這些組蛋白乙酰化酶通常在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)，使機(jī)體處于去乙酰化狀態(tài)，很多抑癌基因的表達(dá)受到了抑制，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26,27]。組蛋白的甲基化往往促進(jìn)基因的表達(dá)，如組蛋白H3上賴氨酸位點(diǎn)的甲基化2MeH3K9參與調(diào)控了多個(gè)基因的表達(dá)。本研究顯示，SAHA和TSA可以下調(diào)肺癌細(xì)胞中HDAC3和HDAC4的表達(dá)，促進(jìn)了2MeH3K9的表達(dá)，對(duì)HDAC1和HDAC2表達(dá)沒(méi)有明顯影響，我們推測(cè)SAHA和TSA引起MDR1和MRP1不同表達(dá)的原因可能和這個(gè)機(jī)制有關(guān)，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)很有必要繼續(xù)深入探討潛在的機(jī)制。

總之，SAHA和TSA可以促進(jìn)A549、SK-mes-1細(xì)胞中MDR1表達(dá)上調(diào)和MRP1表達(dá)下調(diào)，機(jī)制可能是其可促進(jìn)組蛋白的乙酰化和甲基化。