環介導等溫擴增技術的研究與應用

洪穎 段勇 徐秋月

doi：10.3969/j .issn.1007 -614x.2018.5.1

摘要 本文介紹環介導等溫擴增技術（LAMP）原理、特點及應用前景。因LAMP具有特異性高、靈敏度高、易操作、污染風險低的特點，因而目前在傳染病、真菌、細菌，檢測領域中作為診斷工具得到了認可。

關鍵詞 環介導等溫擴增技術；研究；應用

環介導等溫擴增技術（LAMP）是在20世紀90年代核酸擴增技術研究及應用基礎上，逐漸提出并廣泛應用的一種新的技術方式，它在實際應用中能夠根據靶基因6個不同區域進行4種特異引物設計，并通過恒溫環境以鏈置換DNA聚合酶為反應條件，實現核酸擴增反應。在反應過程中，該技術不需要進行長時間溫度循環以及紫外觀察、模板熱變性等較為繁瑣的反應過程，具有簡單、快捷以及特異性突出等技術特點，在生命科學研究以及相關領域中具有較廣泛的應用價值[1]。

環介導等溫擴增技術及其原理分析

LAMP在進行DNA擴增過程中，主要通過進行4種不同特異性引物設計，實現靶基因的6個特定區域識別，同時在恒溫條件下完成擴增反應[2]。值得注意的是，環介導等溫擴增技術在進行DNA擴增過程中能夠將基因擴增與產物檢測同步實現，并且擴增反應的效率較高，一般15～ 60 min左右就能夠實現109～1 010倍基因擴增，并且該技術的特異性比較突出，對于靶基因序列的檢測，能夠只利用有無擴增產物進行判斷與識別，具有較為突出的技術特征與優勢。

引物的設計：環介導等溫擴增技術在擴增反應應用中，其引物設計主要是結合靶基因3端Flc、F2c、F3c區以及5端Bl、B2、B3區共6個不同區域進行4種特異性引物設計，即FIP、F3、BIP、B3共4種特異性引物例。其中，FIP屬于上游內部引物，主要構成于F2區，該區域和靶基因的3端F2c區一級5端Flc區分別呈互補與相同關系；而F3引物則為上游外部引物，主要構成于F3區域，該區域和靶基因中的F3c區域呈互補關系；同時，BIP引物為下游內部引物，B3引物為下游外部引物，它們分別構成于靶基因的B2、B3區域，與靶基因的B2c、Blc、B3c區域呈互補或序列相同關系。環介導等溫擴增技術中的靶基因區域與引物設計關系圖，見圖1。

環介導等溫擴增技術進行DNA擴增反應，主要是根據DNA在恒溫（約65℃）環境下的動態平衡狀態，其包括啟動和循環兩個階段：靶基因Flc和Fl互補，靶基因F2和F2c、 F3c和F3、B3c和B3、B2c和B2、Blc和Bl互補。F2和Flc組成了FIP，Blc和Bl互補成BIP；LF是正向環引物，可結合于Fl和F2之間的環結構，使反應速度加快；而作為反向環引物的LB，可結合于Bl和B2之間的環結構，使反應速度加快。啟動階段時間很短，分子結合復制過程是由核酸等溫擴增通過全部6段特異序列來識別靶DNA，這6段特異序列來自4條特異引物，正常核酸擴增啟動的條件是這6段特異序列完全匹配。在全面擴增的時間中，循環階段達>95%，對靶DNA識別依靠的是4段特異序列（FIP，BIP，LF和LB），只有這4段特異序列完全匹配才能進行互補，進行不斷循環擴增，這樣就保證了核酸等溫擴增的特異性與準確性，見圖2。

LAMP的產物分析：LAMP擴增產物是通過目測渾濁度、離心后對沉淀熒光染料進行觀察和電泳這幾種方式來檢測。LAMP擴增副產物為白色沉淀，即焦磷酸鎂，其可肉眼觀察。而LAMP反應中焦磷酸鎂沉淀的形成與所產生的擴增片段的量之間呈線性關系。因此對靶基因是否存在的判斷通過觀察反應中白色沉淀的有無即可。LAMP熒光檢測試劑中的鈣黃綠素初始與錳離子結合以產生驟冷效應。副產物的焦磷酸根與錳離子結合并從鈣黃綠素上帶走錳離子使其產生熒光，肉眼即可明顯觀察到。由此管內出現熒光即表明目標基因被大量擴增。LAMP產物也可使用瓊脂糖凝膠電泳檢測形成一組梯狀帶。

環介導等溫擴增技術的應用研究

LAMP技術的發展與研究近年最主要在兩個方面：首先是在臨床上的實際應用；其次是原有技術的不斷改進。所以LAMP被發明以來許多的實驗人員將其應用于各種病原體的檢查并與各種PCR的方法進行比較。因LAMP具有短時間內大量擴增相應的靶序列且不需要特殊的精密儀器及實驗室場地，故被廣泛應用在各種病原生物體及相關的疾病診斷上[4]。

傳染性疾病檢測的應用及研究：當前通過LAMP技術方式實現的病毒檢測項目主要包括乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒以及腮腺炎病毒、麻疹病毒、SARS冠狀病毒等[5]，同時，有研究顯示，在以環介導等溫擴增技術以及聚合酶鏈反應兩種不同方式進行7種不同類型的人類皰疹病毒DNA擴增反應中，以焦磷酸鎂濁度檢測方式進行檢測顯示，30 min的環介導等溫擴增反應靈敏度約為500拷貝/管，而60 min的靈敏度達到250拷貝/管，并且只有HHV-7的DNA底物在反應中生成環介導等溫擴增產物，其余情況均不能發現相應的反應產物[6]。并且其敏感的極限與PCR法比較可達到10的拷貝數。由此可見，環介導等溫擴增檢測在傳染性疾病檢測中能滿足快速檢測的要求。

細菌檢測的應用：LAMP首先是以16sRNA這段保守序列作為靶基因，成功的設計出可同時檢測肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌和無乳鏈球菌的引物[7、8]，因LAMP的高度特異性，故這4種細菌與其他的細菌都不會發生交叉反應。而對于結核分枝桿菌，LAMP可從口痰中鑒定出來，操作非常的（簡單）方便，僅僅將所有的混合反應物放于63℃孵育，并在反應的試管中加入SYBR Green I，若有擴增產物則呈綠色。并且LAMP無論是在固體培養基還是液體培養基中都能培養出結核分枝桿菌，大大縮短了傳統鑒定結核桿菌的時間。

真菌檢測的應用：肺孢子菌是一種具有宿主特異性的機會感染致病菌[9]，引起的肺孢子菌肺炎（PCP）臨床體征不明顯且病原學診斷不特異，據相關文獻報道用LAMP的方法檢測PCP患者的口痰及肺泡灌洗液的肺孢子菌的檢出率遠遠高于PCR的方法。

環介導等溫擴增技術作為一種新的核酸擴增方法，本身具有較突出的特異性強的優勢，并且在反應的初期，核酸擴增儀6n倍量進行擴增，30～ 60min即可擴增出109～1 010拷貝的目的基因來，具有高效的靈敏度，比傳統的PCR高出2～3個數量級，并且結果判定肉眼即可完成。在病毒和細菌容易變異的今天，LAMP技術可最大程度滿足臨床快速診斷需要。隨著LAMP技術的不斷完善和改進，相信LAMP技術會在快速檢測感染性疾病方面有著更為廣闊的前景。

參考文獻

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