Ebp1和Ki67蛋白在胃癌組織中的表達變化及臨床意義

權明吉，樸正根，滕永旺，許東元，劉蘭，金頭峰

(1 延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000；2 濟寧市第一人民醫院)

胃癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，因其發病率及病死率高而嚴重影響人們的生命及健康。近年來隨著分子生物技術的發展，胃癌分子靶向治療研究成為了熱點。表皮生長因子受體(HER)家族包括HER1(EGFR)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)4個成員，能調節細胞生長、分化、遷移及其他細胞功能。已有研究發現，HER2為靶點的靶向治療能延長胃癌患者的總生存期[1]。Ebp1蛋白是一種最新發現的ErbB3結合蛋白，在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中異常表達，且Ebp1蛋白表達與各腫瘤的臨床分期及預后等有關[2～5]。有研究表明，胃癌組織中ErbB3較正常胃組織表達增高，在胃癌中起到重要作用[6]。故Ebp1蛋白作為ErbB3的結合蛋白，有可能與胃癌有關。Ki67蛋白是一種增殖細胞相關核蛋白，可反映細胞的增殖狀況，且作為重要的細胞增殖標記物，應用于各種腫瘤疾病的研究中。有研究報道，Ki67蛋白在胃癌組織中高表達，且與胃癌的病理特征及預后相關[7～9]。但目前Ebp1蛋白在胃癌組織中的表達變化及Ebp1和Ki67蛋白在胃癌組織中表達的相關性鮮有報道。本研究通過檢測胃癌組織及癌旁組織中Ebp1和Ki67蛋白的表達差異，探討二者的相關性，為胃癌的發生、發展機制研究及分子靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集延邊大學附屬醫院2011年1月～2013年11月收治的胃癌患者121例，術中均留取癌組織。患者中男90例，女31例；年齡<60歲37例，≥60歲84例；漢族79例，朝鮮族42例；腫瘤組織高中分化40例，低分化81例；腫瘤直徑<5 cm 71例，≥5 cm 50例；Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型102例，Ⅲ型+Ⅳ型19例；TNM分期T1～T2期17例，T3～T4期104例；淋巴結轉移84例，無淋巴結轉移37例。術中另收集60例患者相應的癌旁組織作為對照，男32例，女28例；年齡<60歲26例，≥60歲34例；漢族41例，朝鮮族19例。術前均未行放、化療，術后病理學檢查證實癌組織均為胃腺癌、相應癌旁組織均未見累及。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 Ebp1和Ki67蛋白檢測方法 采用免疫組化SP法。所有樣本離體后經4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片；常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；抗原熱修復，在0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸10 min，自然冷卻；3% H2O2孵育，滅活內源性過氧化物酶，PBS沖洗；血清封閉后，滴加一抗，4 ℃過夜孵育，PBS沖洗；滴加聚合酶輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的多抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，沖洗、復染、脫水、封片。以試劑盒自帶的陽性對照片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。Ki67蛋白陽性表現為細胞核呈棕黃色；Ebp1蛋白陽性表現為細胞核呈黃色或棕褐色，細胞質偶可出現著色。隨機選5個高倍鏡視野，根據陽性細胞百分率及染色強度判斷結果。陽性細胞百分率<10%為0分、10%～<25%為1分、25%～<50%為2分、≥50%為3分，染色強度淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩項指標得分相乘，0為-，1～2為+，3～4為++，5以上為+++。+～+++判為陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料以百分數表示，胃癌組織與癌旁組織中Ebp1和Ki67蛋白表達比較行χ2檢驗，Spearman等級相關分析Ebp1和Ki67蛋白的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ebp1和ki67蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達 胃癌組織Ebp1和Ki67蛋白陽性表達率分別為26.45%(32/121)、73.55%(89/121)，均高于癌旁組織的5.00%(3/60)和0(P均<0.05)。

2.2 Ebp1和Ki67蛋白陽性表達與胃癌臨床病理參數的關系 Ebp1蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、有淋巴結轉移胃癌組織中的陽性表達率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化及無淋巴結轉移者(P均<0.05)，但Ebp1蛋白表達在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑、TNM分期之間差異無統計學意義(P均>0.05)。Ki67蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、TNM分期T3～T4期、有淋巴結轉移胃癌組織中的陽性表達率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化、TNM分期T1～T2期、無淋巴結轉移者(P均<0.05)，但Ki67蛋白表達在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑之間差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.3 胃癌組織中Ebp1和ki67蛋白表達的關系 胃癌組織中Ebp1蛋白與Ki67蛋白表達呈正相關(r=0.34，P<0.05)。見表2。

表1 Ebp1和Ki67蛋白陽性表達與胃癌臨床病理參數的關系

表2 胃癌組織中Ebp1和Ki67蛋白表達的關系(例)

3 討論

這些年來，人們雖然不斷深入研究胃癌的發生及發展機制，不斷提高胃癌的臨床診斷及治療技術，但胃癌的發病率及病死率仍不低。而在中國，不僅胃癌的發病率及病死率高，早期胃癌發現率低，更有胃癌年輕化傾向[10]。所以，一直以來攻克胃癌是許多臨床醫師及基礎研究者們的愿望。本研究采用免疫組化SP法檢測Ebp1蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達，發現Ebp1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織。這與Gannon等[4]在前列腺中及Liu等[3]在宮頸癌中的研究結果相一致。進一步分析Ebp1蛋白陽性表達與胃癌臨床病理參數的關系，發現Ebp1蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、有淋巴結轉移胃癌組織中的陽性表達率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化及無淋巴結轉移者，但Ebp1蛋白表達在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑、TNM分期之間差異無統計學意義。這表示Ebp1蛋白在胃癌組織中高表達，且與胃癌的Borrmann分型、分化程度及淋巴結有無轉移相關。Ki67蛋白是目前研究者們認可的與細胞增殖相關的一種細胞核抗原標記物，其功能與有絲分裂有關。Ki67蛋白在細胞分裂早期表達水平較低，而隨著細胞分裂表達水平逐漸增高，M期到達最高值，之后隨著細胞分裂過程結束，表達水平逐漸下降。Ki67蛋白作為腫瘤增殖標記物，應用于腫瘤的基礎及臨床研究中[11]。本研究結果顯示，Ki67蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、TNM分期T3～T4期、有淋巴結轉移胃癌組織中的陽性表達率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化、TNM分期T1～T2期、無淋巴結轉移者，但Ki67蛋白表達在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑之間差異無統計學意義。這表明Ki67在胃癌中高表達，且與胃癌的Borrmann分型、分化程度、腫瘤TNM分期及有無淋巴結轉移相關。這與劉偉等[8]研究結果基本一致，且與其他研究[7,9]結果有相同之處。

我們進一步分析了Ebp1和Ki67蛋白之間的相關性，發現Ebp1和Ki67蛋白在胃癌組織中的表達呈正相關，這與劉蘭等[12]在宮頸癌組織中研究結果相一致。而Ki67蛋白是常見的腫瘤增殖相關標志物之一，因此我們考慮Ebp1蛋白可能與胃癌細胞增殖有關。Kim等[13]報道，神經膠質瘤細胞中Ebp1蛋白有促進腫瘤細胞增殖及侵襲作用；但與之相反，崔玲玲等[14]認為在賁門癌中Ebp1蛋白有抑制腫瘤增殖作用。究其原因，可能與Ebp1蛋白有兩種亞型p48及p42有關。有研究者認為，p48有致癌作用，能促進腫瘤的增殖，而p42可能有調節基因轉錄功能，是一種有效的腫瘤抑制物，抑制腫瘤的增殖[15]。在不同組織中，p48及p42表達量不同，可能對腫瘤有著不同的作用，當然這有待進一步研究。

總之，本研究發現Ebp1與Ki67蛋白在胃癌的發生、發展過程中起著重要作用，二者可能有相互促進作用；Ebp1和Ki67蛋白表達陽性的患者腫瘤惡性程度更高、侵襲和轉移的傾向也更強，因此聯合檢測Ebp1及Ki67蛋白有助于判斷胃癌的惡性程度及侵襲、轉移能力，且Ebp1蛋白有望成為抑制腫瘤增殖的新靶點。