母系遺傳線粒體糖尿病伴多發耳聾1個家系報告

張勇，郭振奎，丁文宇，王東，劉長青，張憲黨

(山東省內分泌與代謝病研究所，濟南250062)

線粒體糖尿病是由線粒體基因突變導致胰島β細胞氧化磷酸化障礙而引起糖尿病，屬于一種罕見特殊類型糖尿病。線粒體tRNALeu(UUR)3243A→G點突變是線粒體糖尿病最常見的病因。線粒體糖尿病的特征包括：糖尿病呈母系遺傳，合并神經性耳聾，體型偏瘦，發病年齡較早(多在40歲之前)，胰島細胞功能呈進行性衰退(早期即需要胰島素治療)，糖尿病抗體陰性，合并其他神經肌肉病變。由于此類型糖尿病呈現母系遺傳并多伴發耳聾癥狀，因此線粒體糖尿病又被稱為母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征。該病早期臨床表現與1型、2型糖尿病不易區分，臨床上易造成誤診，不利于該病的及時確診及家系遺傳病的發現。目前，對線粒體糖尿病家系的報道少見。2017年3月，我們發現了1個線粒體糖尿病家系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者為女性，36歲，因“視物不清”于2017年3月來我院就診，確診為糖尿病。經詢問病史，發現其家系成員糖尿病發病呈母系遺傳方式，同時伴有耳聾。因此對患者進行線粒體基因突變檢測，發現其存在線粒體tRNALeu(UUR)3243A→G點突變。根據文獻[1]中的診斷標準，確診為線粒體糖尿病。進一步收集該先證者的家系成員20例，男10例、女10例，其中糖尿病6例、耳聾7例、糖尿病合并耳聾6例。糖尿病患者中，年齡最小21歲、最大58歲，BMI均<24.0 kg/m2；除1例新發現的患者未接受藥物治療外，其他5例均接受胰島素治療。本研究經我院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床及家系調查 研究對象進行空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹胰島素、身高、體質量等檢測，并調查家系、并發癥等情況。

1.3 耳聾的診斷 采用純音電測聽檢測聽力。耳聾的診斷標準：純音聽閾表現為氣導骨導聽力同時下降；氣骨導差<10 dB；聽力曲線呈高頻陡降型、平坦型及切跡型等[2]。

1.4 線粒體基因檢測 采集受試者外周血3 mL，-20 ℃保存備用。使用TaKaRa基因提取試劑盒提取外周血的基因組DNA，選擇線粒體3069～3842片段設計引物，上游引物5′-AGTTCAGACCGGAGTAATCCAG-3′，下游引物5′-CATGATGGCAGGAGTAATCAGA-3′。PCR擴增，取擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取合格樣本送華大基因進行直接測序，根據測序峰圖查找突變位點，繪制突變基因的家系圖譜。

2 結果

2.1 家系成員臨床資料 見表1。

表1 家系成員的臨床資料

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為世代序號，“+”為發病，“-”為未發病。

2.2 家系調查結果 家系圖譜見圖1。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為世代序號； □為正常男性； ○為正常女性； ■為男性糖尿病患者； ●為女性糖尿病患者； 為男性3243A→G點突變攜帶者； 為女性3243A→G點突變攜帶者； 為男性死亡患者； 為女性死亡患者。

2.3 基因測序結果 該家系先證者攜帶3243A→G點突變；20例家系成員中，10例攜帶3243A→G點突變，分別是Ⅱ5、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅲ17、Ⅲ19、Ⅲ22、Ⅳ4、Ⅳ11。以同一個小家系中的Ⅱ9、Ⅲ17、Ⅲ19、Ⅳ11為例，其測序結果見圖2。

2.4 3243A→G點突變者的糖尿病和耳聾發病情況 Ⅱ5、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ5、Ⅲ17、Ⅲ19均為糖尿病伴耳聾，Ⅲ3出現耳聾癥狀但血糖處于正常范圍，Ⅲ22、Ⅳ4、Ⅳ11未發現血糖升高及耳聾癥狀。

3 討論

線粒體是細胞核外唯一有遺傳物質的細胞器，人類線粒體DNA結構為長16 569 bp的雙鏈閉環超螺旋DNA，包含2個rRNA基因、13個多肽編碼基因以及22個tRNA基因。線粒體DNA幾乎完全由編碼區構成，因缺少組蛋白保護而容易受損，并且缺乏有效的自我修復機制，其突變頻率明顯高于核基因。1992年，Van den Ouweland等[3]首次報道了線粒體基因tRNALeu(UUR)3243A→G點突變引起的線粒體糖尿病。在全球范圍內的線粒體糖尿病人群中，已發現幾十個線粒體基因突變位點，其中tRNALeu(UUR)3243A→G點突變最為常見[4]。1995年，項坤三等[5]首次在我國發現攜帶tRNALeu(UUR)3243A→G點突變位點的線粒體糖尿病。本研究報道的線粒體糖尿病家系3代成員中，發現7例攜帶該突變位點，其中6例已發生糖尿病，這6例中5例同時合并耳聾。

注：A為Ⅲ17先證者3243A→G點突變；B為Ⅱ9 3243A→G點突變；C為Ⅲ19 3243A→G點突變；D為Ⅳ11 3243A→G點突變。

Olmos等[6]發現，tRNALeu(UUR)3243A→G突變不僅是胰腺細胞分泌胰島素障礙的基礎，還導致了內耳血管邊緣細胞腺苷三磷酸的減少，這樣就減少了柯蒂氏器外毛細胞放大聲波所需要的能量，最終引發聽力損傷。本研究發現，該家系先證者體內存在tRNALeu(UUR)3243A→G點突變。該患者有糖尿病病史13年，伴耳聾癥狀。對其家系調查發現，家系中10例成員具有該變異位點。這種在1個家系中發現10個成員攜帶線粒體突變位點、連續3代均有多人攜帶變異位點的病例，國內少有報道。進一步說明tRNALeu(UUR)3243A→G點突變仍然是線粒體糖尿病的高頻易感位點。本研究中，發生糖尿病伴耳聾的6例家系成員均攜帶該突變位點，突變位點與糖尿病伴耳聾出現明顯的共分離現象。在這10例家系成員中，4例未發生糖尿病，其中1例年長者(Ⅲ3)已出現耳聾癥狀但血糖處于正常范圍，其余3例均未出現糖尿病或耳聾癥狀。這4例成員平素生活規律，他們尚未發生糖尿病及耳聾可能與生活方式及年齡有關。另外，Ⅲ20及Ⅳ12線粒體基因測序未發現該突變位點(理論上應該出現)，這可能與細胞雜胞質性有關。細胞雜胞質性是指線粒體內野生型及突變型基因位點混合存在的一種現象。本病特點是所有患者均呈雜胞質性。攜帶tRNALeu(UUR)3243A→G點突變基因的比例在人體不同組織中會有很大差異，比如白細胞內雜胞質性比例為1%～40%，明顯低于骨骼肌中的70%～90%[7～9]。由于本研究所提取的DNA來自外周血白細胞，對于雜胞質性比較低的家庭成員很可能無法發現突變位點，必要時可以行肌肉活檢以確診。

隨著測序技術普及，線粒體基因突變糖尿病精準診斷逐步成熟。對于明確診斷的此類患者，其治療措施與其他類型糖尿病有所不同。由于該病胰島功能衰減較快，所以確診后應盡快使用胰島素治療。應避免使用二甲雙胍，因為二甲雙胍可以抑制線粒體呼吸鏈復合體1的功能。Suzuki等[10]報道，輔酶Q10治療3年后患者胰島功能明顯提高，聽力得到改善。基因治療從理論上講是一種對因治療，國外學者做了不少探索性的研究。Tachibana等[11]從線粒體基因缺陷患者未受精的卵母細胞中把染色體(核遺傳物質)分離并移植到另一個去核健康卵母細胞質中，這樣新細胞含有健康的線粒體DNA以及其他細胞器、RNA和蛋白質。這一技術在猴子模型中獲得了成功。Tonin等[12]通過特別設計的RNA分子，能夠選擇性地與突變的線粒體基因組退火。在導入培養人體細胞的線粒體后，這些RNA能使線粒體基因中攜帶致病點突變的DNA比例降低。研究發現，將攜帶健康目的線粒體基因的質粒包封在納米顆粒中，然后導入細胞內，使本來存在缺陷的線粒體基因得以正確表達。這些治療策略將來有可能用來治療線粒體糖尿病。但由于目前科學技術水平的限制，基因治療真正走向臨床還需要大量研究工作。