幽門螺桿菌對人組織淋巴瘤細胞的損傷作用及機制

宋光永，張曉榮，郭松佳，高艷萍

(山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽032200)

幽門螺桿菌(Hp)是一種微需氧型的革蘭陰性螺旋桿菌，生存于胃部及十二指腸的各區域內，可引起胃黏膜慢性炎癥，促進消化性潰瘍和胃惡性腫瘤的發展。研究表明，胃癌的發生與Hp感染呈顯著正相關，世界衛生組織和國際癌癥研究機構已經將Hp明確定義為Ⅰ級致癌物[1，2]。Hp入侵宿主后，相關炎癥因子如人巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、白細胞介素1β(IL-1β)等表達升高，并激活胃黏膜相應的免疫反應，從而刺激單核巨噬細胞消除Hp[3]。人組織淋巴瘤細胞屬于單核巨噬細胞，主要通過分泌腫瘤壞死因子、MIF、單核細胞趨化蛋白1等炎癥因子產生免疫炎癥反應，并通過調節核因子κB(NF-κB)信號通路的重要調節因子，共同抵御Hp對機體的損害[4]。2017年10月，我們采用Hp處理人組織細胞淋巴瘤細胞系U937，觀察炎癥因子的變化，探討Hp引起慢性炎癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hp標準菌株由山西醫科大學基礎醫學部饋贈。U937細胞、RPMI1640細胞培養基、胎牛血清購于武漢博士德生物技術有限公司。MIF、IL-1β ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司；實時熒光定量試劑盒(SYBR Green)、瓊脂糖、Taq酶購于北京天根生物技術有限公司；核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)、NF-κB p65兔抗人抗體、β-actin抗體、CCK-8試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。Hp標準菌株由山西醫科大學基礎醫學部饋贈。U937細胞、RPMI1640細胞培養基、胎牛血清和MIF、IL-1β ELISA試劑盒、CCK-8試劑盒以及IκB-α、NF-κB p65兔抗人抗體、β-actin抗體購于武漢博士德生物技術有限公司；實時熒光定量試劑盒(SYBR Green)、瓊脂糖、Taq酶購于北京天根生物技術有限公司。

1.2 Hp培養 以93 mL液體哥倫比亞基礎培養基、7 mL新鮮脫脂羊血、1 mL混合添加劑制成固體培養基，用接種環將Hp菌株接種到固體培養基上，置入含O2、N2和CO2的混合氣袋中，37 ℃培養5 d左右。待水珠針尖樣菌體出現后，用接種環輕輕刮下Hp，加入RPMI1640培養基震蕩混勻，使用紫外分光光度計測其OD值，1個OD值相當于1×108CFU/mL，得出細菌母液濃度為1.5×109CFU/mL。

1.3 U937細胞培養、分組及Hp干預方法 將細胞加入RPMI1640細胞培養基，37 ℃、5% CO2氣體培養箱中培養2 d，待細胞長滿后用12孔板進行多孔培養。將細胞隨機分為Hp組和對照組。Hp組按細菌與細胞100∶1的比例加入Hp，對照組加入等體積RPMI1640培養液，培養14 h。

1.4 細胞上清中MIF、IL-1β水平檢測 采用ELISA法。取兩組細胞，離心取上清，檢測MIF、IL-1β水平。按試劑盒說明書以標準品繪制標準曲線，根據標準曲線計算MIF、IL-1β表達量。采用GraphPad Prism 5軟件進行數據分析。

1.5 細胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA檢測 采用RT-PCR法。收集兩組細胞，采用TRIzol試劑提取細胞RNA。測定純度及濃度后，置于-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒步驟合成cDNA，進行PCR擴增。引物序列：MIF上游5′-GCAGAACCGCTCCTACAGCA-3′，下游5′-GGCTCTTAGGCGAAGGTGGA-3′，擴增片段長度141 bp；IL-1β上游5′-CTTCGAGGCACAAGGCACAA-3′，下游5′-TTCACTGGCGAGCTCAGGTA-3′，擴增片段長度108 bp；IκB-α上游5′-GCTGAAGAAGGAGCGGCTACT-3′，下游5′-TCGTACTCCTCGTCTTTCATGGA-3′，擴增片段長度72 bp；NF-κB上游5′-CACTTATGGACAACTATGAGGTCTCTGG-3′，下游5′-CTGTCTTGTGGACAACGCAGTGGAATTTTAGG-3′，擴增片段長度406 bp；GAPDH上游5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′，下游5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，擴增片段長度251 bp。反應條件：95 ℃預變性10 s；55 ℃ 20 s延伸；72 ℃ 30 s，共40個循環。計算Ct值，應用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.6 細胞毒性觀察 采用CCK-8法。取兩組細胞，按100 μL/孔加入96孔板中。加入10 μL CCK-8溶液，放入細胞培養箱內繼續培養1 h，用分光光度計測量450 nm處的吸光度OD值，OD值越高代表細胞的毒性越低、細胞的增殖能力越強。

1.7 細胞IκB-α、NF-κB蛋白檢測 采用Western blotting法。使用蛋白質提取試劑盒提取細胞中的蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。而后進行配膠(分為5%濃縮膠和12%分離膠)、上樣、電泳、封閉，以兔抗人IκB-α、NF-κB p65、β-actin抗體為一抗，辣根過氧化物酶酶標標記為二抗，最后加入ECL顯色液進行曝光。以蛋白條帶的灰度值與β-actin的比值作為檢測結果。

2 結果

2.1 兩組細胞上清中MIF、IL-1β水平比較 Hp組細胞上清中MIF、IL-1β水平較對照組升高(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞上清中MIF、IL-1β水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達水平比較 Hp組MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達水平均較對照組均升高(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 兩組細胞毒性比較 Hp組和對照組細胞的OD值分別為0.17±0.00、0.41±0.05，Hp組較對照組活細胞數量減少，細胞毒性增強(P<0.01)。

2.4 兩組細胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達比較 Hp組細胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達水平均較對照組升高(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組細胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

Hp是一種微需氧性質的革蘭陰性彎狀桿菌，寬0.5～1 μm、長2.5～5 μm，細胞柱上的鞭毛能促進其自身的流動，并造成宿主黏膜損傷。目前關于Hp如何逃脫免疫監視導致慢性感染和炎癥的機制仍未完全闡明[5]。Hp作為致癌因子，在Hp感染機體后損害胃及十二指腸黏膜，產生TNF-α、白細胞三烯、IL-1、MIF等，促進黏膜的炎癥損傷；隨后炎癥因子趨化活化的人U937細胞做出及時的免疫防御反應。人U937細胞是機體重要的免疫調節和效應細胞，活化的巨噬細胞分泌細胞因子的量會明顯增加，產生TNF-α、MIF、IL-6、IL-1β等，促進機體黏膜的免疫炎癥損傷[6]。TNF-α、MIF、IL-1β等炎癥因子在慢性炎癥的啟動中也是必不可少的[7]，MIF、IL-1β、IL-6可以促進結腸和胃黏膜的慢性炎癥及后續的癌變過程[8，9]，這些過程主要與STAT1和STAT3的過度激活有關[10]；同時在炎癥因子發生作用的時候能夠誘導DNA的慢性損傷從而導致機體細胞的凋亡[11]。

目前，關于Hp以及Hp刺激巨噬細胞的研究較多，但有關Hp感染人組織淋巴瘤細胞的研究并不多。Hp作為一級致癌物質，已經引起格外關注。本研究結果顯示，Hp組炎癥因子MIF、IL-1β的分泌量較對照組增加，表明Hp感染巨噬細胞系U937細胞后，能夠促進U937細胞炎癥因子MIF、IL-1β分泌，進而誘導機體做出一定的免疫防御反應，間接性抑制菌體對感染者的進一步損害。Hp感染后人U937細胞的毒性增強，這可能與細胞炎癥因子分泌量增多有關。Hp組MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表達水平均較對照組升高，證實炎癥因子表達升高，更進一步說明了細胞毒性升高的原因和機制，即人U937細胞經Hp感染后直接引起了細胞炎癥因子分泌量的增加及細胞毒性的加強。

NF-κB是由p50和p65亞基組成的異源性質的二聚體[12]，是正常表達在許多細胞質內的一種重要的多功能核轉錄因子，其激活后參與許多基因的轉錄調控，在炎癥、免疫反應、氧化應激等過程中發揮重要作用。巨噬細胞中NF-κB信號通路激活后能夠誘導炎癥因子如IL-1β、MIF、TNF-α等過度表達，使得炎癥反應加劇[13]。本研究結果顯示，Hp組細胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表達水平較對照組升高，表明Hp感染巨噬細胞系U937細胞后，激活了NF-κB信號通路，在此基礎上調控Hp對宿主黏膜的免疫炎癥損傷。

綜上所述，Hp感染人組織淋巴瘤細胞后可誘導MIF、IL-1β等炎癥因子分泌增加，加速NF-κB信號通路的激活，進而引起重要信號通路蛋白NF-κB p65、IκB-α表達升高，最終形成一個完備的炎癥微環境，擾亂機體的免疫防御反應，導致胃黏膜慢性炎癥的發生發展。