開心果總黃酮預處理對急性肝損傷小鼠肝組織的保護作用及機制

依明·尕哈甫，麥爾旦·吐爾遜麥麥提，熱娜·卡斯木，韓南銀

(1新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊830011；2北京大學藥學院)

肝損傷疾病發病率高、治療難度大，如果未得到及時治療，會進一步誘導脂肪肝、肝硬化、肝纖維化甚至肝癌的發生。肝損傷是多因素參與的復雜病理過程，研究表明，氧化應激和炎癥在肝細胞病變過程中發揮重要作用[1]。然而，目前關于肝損傷的發病機制還未全面闡明，尚缺乏特效的治療藥物。開心果中含有的黃酮類化合物是一類具有多種生物活性的天然產物，具有抗氧化、抗炎、保肝等功能[2]。2017年12月～2018年3月，我們采用四氯化碳(CCl4)建立大鼠急性肝損傷模型，觀察開心果總黃酮對血清谷草轉氨酶(ALT)、谷丙轉氨酶(AST)以及炎癥因子白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響，并測定肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、還原型谷胱甘肽(GSH)等氧化應激指標和肝臟組織的病理學變化，探討開心果總黃酮抗肝損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級健康昆明種小鼠50只，體質量(20±2)g，雌雄各半，購自新疆醫科大學實驗動物中心。開心果購自新疆維吾爾自治區維吾爾醫院，取開心果粉末經10倍量的80%乙醇回流提取3次并減壓濃縮，濃縮液經D101型大孔吸附樹脂洗脫純化，選取70%乙醇洗脫液并濃縮至浸膏，再經冷凍干燥成粉末，測得總黃酮含量為63.29%。將總黃酮干燥粉末用0.3%的羥甲基纖維素鈉混勻。CCl4(天津永晟化學試劑廠)；總蛋白定量(BCA法)、SOD、MDA、NO和GSH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α檢測試劑盒(博士德生物有限公司)。BS-450型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療有限公司)；UV-754型紫外-可見分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)；RT-6100型酶標儀(深圳雷社生命科學有限公司)；TGL-16M型冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；HH型恒溫水浴鍋(金壇科析儀器有限公司)。

1.2 動物分組與干預 將小鼠隨機分為正常組、模型組及開心果總黃酮低、中、高劑量組各10只。開心果總黃酮低、中、高劑量組分別給予100、200、400 mg/kg開心果總黃酮灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續7 d。

1.3 肝損傷模型的建立 末次給藥1 h后，正常組給予花生油溶液0.1 mL/10 g體質量腹腔注射，模型組和開心果總黃酮組小鼠均以0.1%的CCl4花生油溶液(0.1 mL/10 g體質量)腹腔注射建立急性肝損傷模型，禁食不禁水繼續飼養8 h。

1.4 血清ALT、AST、IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平檢測 造模后8 h，小鼠摘眼球取血1.5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清。使用全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平，酶標儀檢測小鼠血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 肝臟指數、脾臟指數測算 經頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟和脾臟并稱重，計算肝臟指數和脾臟指數。臟器指數=臟器濕重(mg)/小鼠體質量(g)。

1.6 肝組織病理學檢查 剖取小鼠肝臟左葉距邊緣0.5 cm處的組織置于10%甲醛溶液中固定，經HE染色法制備切片，在400倍光鏡下觀察小鼠肝組織病理學變化。

1.7 肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平檢測 取0.5 g小鼠肝臟組織，置于冰生理鹽水中冷藏，冰浴研磨成組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液。紫外分光光度法檢測SOD、MDA、NO、GSH水平，按照試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 各組血清ALT、AST水平比較 與正常組比較，模型組血清ALT、AST水平均升高(P均<0.01)。與模型組比較，開心果總黃酮中、高劑量組血清ALT、AST水平均降低(P均<0.01)。見表1。

表1 各組血清ALT、AST水平比較

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.2 各組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平升高(P均<0.05)。與模型組比較，開心果總黃酮中、高劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 各組肝臟指數、脾臟指數比較 與正常組比較，模型組肝臟指數、脾臟指數均升高(P均<0.05)。與模型組比較，開心果總黃酮中、高劑量組肝臟指數、脾臟指數均降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組肝臟指數、脾臟指數比較

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.4 各組肝組織病理檢查結果比較 正常組肝小葉結構完整，肝細胞結構清晰，無炎性細胞浸潤及纖維組織增生，無明顯變性壞死。模型組肝小葉結構和肝細胞排列紊亂，肝細胞水腫，部分肝細胞壞死或氣球樣改變，細胞質變疏松，肝細胞脂肪變性多見，可見碎片狀和點狀壞死，存在炎性細胞浸潤。與模型組相比，開心果總黃酮組尤其是中、高劑量組，肝細胞水腫減輕，肝細胞壞死和脂肪變性減少，偶見浸潤的炎性細胞，肝小葉結構基本完整，病理組織顯著改善。

2.5 各組肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比較 與正常組比較，模型組肝組織中MDA、NO水平升高，SOD、GSH水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，開心果總黃酮中、高劑量組血清MDA、NO水平降低，SOD、GSH水平升高(P均<0.05)。見表4。

表4 各組肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

肝臟作為體內重要的代謝和解毒器官，對化學物質、藥物、免疫性疾病、乙醇等損傷因素非常敏感，肝損傷可表現為肝組織壞死、肝脂肪化、肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌[3]。肝損傷的治療原則為維護肝細胞功能的穩定性，減少肝細胞組織炎癥的程度，促進損傷組織的修復等[4]。目前治療肝損傷的藥物很多，如抗炎保肝類、修復肝細胞膜性結構類、解毒保肝類、抗肝纖維化類、利膽保肝類等。目前對肝損傷的防治仍是一個重要課題，通過實驗性肝損傷動物模型篩選治療肝損傷藥物，探討其作用機制，具有重要的現實意義。肝損傷過程大多與氧化應激和免疫有關，化學物質、藥物、乙醇等能直接或間接誘導肝細胞生物膜系統發生脂質過氧化，干擾細胞內的能量代謝，活化細胞死亡程序等，最終以轉氨酶升高為表現形成不同程度的肝功能失常[5]。CCl4可導致肝細胞脂質過氧化，破壞肝細胞生物膜結構的完整性，造成肝細胞損傷壞死，致使肝細胞內的兩種轉氨酶ALT和AST大量溢出并進入血液，血漿ALT、AST水平升高[6]。此外，產生的過多的自由基將會耗竭SOD、GSH而使其減少[7]，而脂質過氧化產物MDA和NO濃度會隨著肝細胞膜結構和功能的損傷而顯著提高[8]。肝損傷過程存在不同程度的肝臟炎癥，并導致炎性細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ等的釋放增加[9]。近年來，中醫藥在治療肝損傷研究中表現出了穩定的療效、較少的不良反應等優勢，特別是中藥中含有的黃酮類化合物可以通過抗炎、提高肝組織抗氧化水平、消除自由基等作用保護肝臟[10]。

開心果是漆樹科植物阿月渾子的果實或種子，是日常生活中常食用的一種干果，同時也作為中藥民族藥使用。據維吾爾醫學典籍記載，開心果具有開通肝阻作用，主治肝臟有阻[11]。藥理學研究顯示，開心果具有抗炎和抗脂質過氧化作用[12]。開心果總黃酮中含有柚皮素、大豆苷元、染料木素、槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等黃酮類成分[13]，現代藥理研究證實，其中的部分黃酮類化合物具有保肝作用[14，15]。本研究通過觀察開心果總黃酮防治肝損傷的作用，為進一步開發開心果中具有保肝作用的有效成分提供理論依據。

本研究結果顯示，給予開心果總黃酮預處理后，肝損傷小鼠血清ALT、AST水平降低，ALT和AST都屬于轉氨酶，轉氨酶是人體代謝過程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細胞內，在肝細胞發生炎癥、壞死、中毒等損傷時水平會升高，經開心果總黃酮給藥治療后，小鼠血清ALT和AST水平下降，說明開心果總黃酮抑制了轉氨酶升高，肝損傷在逐漸恢復。開心果總黃酮各劑量組SOD、GSH均升高且NO、MDA均降低，顯示了開心果總黃酮的抗氧化保肝作用；同時開心果總黃酮中、高劑量組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ的炎性細胞因子水平顯著下降，說明開心果總黃酮通過下調炎癥反應作用來抑制炎癥因子的產生，減緩對肝臟的毒性，減慢肝細胞壞死，從而起到對肝臟的保護作用。此外，給藥后肝損傷小鼠的肝臟指數、脾臟指數均下降，小鼠肝臟的病理損傷程度得到顯著改善，提示臟器充血、水腫、壞死等現象得到了糾正。

綜上所述，開心果總黃酮對CCl4誘導的急性肝損傷具有保護作用，其作用機制可能是抑制肝臟組織中自由基脂質過氧化反應，保護肝細胞膜的完整性，并降低血清ALT、AST水平，增強機體抗氧化能力，抑制炎癥因子釋放，減輕炎癥反應，從而發揮抗炎和保肝的功效。