口腔種植體周圍炎齦溝液中IL-6和NF-κB的表達分析

李洪波 黃 鶴 李巧梅 石 磊

1.南方醫科大學深圳口腔醫院 深圳牙科醫療中心，廣東深圳 518001；2.深圳市人民醫院，廣東深圳 518020

種植體周圍炎在臨床上口腔科較為常見，發生率約為28%～56%，是指發生于種植體周圍軟硬組織的炎癥，常導致種植體骨結合失敗、支持骨喪失，甚至可導致種植體松動脫落。目前臨床上關于其發病機制尚未明確，多認為與微生物侵襲種植周圍組織所致。探討種植周圍炎發病機制，為臨床種植體周圍炎的防治提供指導是目前面臨的主要課題。本研究通過2015年4月～ 2016年4月期間我院接收的120例在我院進行種植義齒治療的患者資料進行回顧性分析，探討IL-6及NF-κB表達在種植體周圍炎發生發展中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取120例在我院進行種植義齒治療的患者，入院時間為2015年4月～2016年4月，其中女47例，男73例，年齡22～65歲，平均（45.3±2.1）歲，病程2～10年，平均（5.8±1.2）年，共有126顆種植牙，以種植體周圍是否發生炎癥分為炎癥種植體組45例（51顆），其中女20例，男25例，年齡22～64歲，平均（45.2±1.8）歲，病程3～10年，平均（6.3±1.2）年，健康種植體組75例（75顆），其中女27例，男48例，年齡23～65歲，平均（45.3±1.9）歲，病程2～8年，平均（6.2±1.3）年。種植體周圍炎組根據種植體周圍炎疾病分類標準分為三組，即輕度種植體周圍炎組15例（輕度組，15顆）、中度種植體周圍炎組19例（中度組，20顆）、重度種植體周圍炎組11例（重度組，16顆），其中輕度組中，女6例，男9例，年齡22～62歲，平均（45.1±1.5）歲；中度組中，女9例，男10例，年齡23～64歲，平均（45.3±1.4）歲；重度組中，女5例，男6例，年齡22～63歲，平均（45.2±1.6）歲。把對側同名健康天然牙為對照組60例（67顆），均為同期在我院進行體檢的人群，其中女29例，男31例，年齡21～65歲，平均（45.3±1.9）歲。

1.2 納入標準

患者研究前3個月內未進行免疫制劑、抗生素及非甾體類藥物治療；種植的義齒＞3個月；種植后進行口腔衛生的維護，依從性良好；種植義齒無咬合創傷；身體健康，且患者知情同意；無妊娠。

1.3 診斷標準[1]

近中或遠中陰溝出血指數（SBI）≥1位點，菌斑指數（PLI）≥ 1，探診深度（PD）≥ 3mm；（2）形成中牙周袋；（3）種植體松動；（4）X線顯示種植體頸部有骨吸收投影區。輕度種植體周圍炎：骨喪失深度＜25%種植體長度，PD≥4mm伴出血和（或）探診溢膿；中度種植體周圍炎：骨喪失深度25%～50%種植體長度，PD≥6mm伴出血和（或）探診溢膿； 重度種植體周圍炎：骨喪失深度＞50%種植體長度，PD≥8mm伴出血和（或）探診溢膿。

1.4 采集和測量齦溝液

將Whatman3號濾紙裁剪成2mm×10mm濾紙條，消毒后于清潔微量離心管中稱重后備用。將菌斑去除牙面擦干后，將濾紙條插入種植體和天然牙的牙冠遠中、近中頰側和舌（鄂）側齦溝中，60s后取出放入原始EP管中稱重。計算齦溝液質量（采集齦溝液質量與濾紙條質量的差值）。按比重（1mg/μL）換算為體積（μL）。將EP管中加入磷酸鹽緩沖劑（PBS）200μL后，震蕩1h，低溫離心后取上層清夜于-80℃低溫保存。

1.5 齦溝液NF-κB及炎癥因子測量

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測量NF-κB及IL-6水平，試劑盒由武漢博士德生物技術有限公司提供。將-80℃ 保存的EP管取出后，常溫解凍，在常溫搖床上放置1h，加入100mL PBS中用于重新洗脫樣品。在ELISA板處理前輕輕搖動試管1min，之后以轉速5000rap在4℃下離心30min。嚴格按照ELISA試劑盒說明程序測定NF-κB和IL-6的樣品含量。將使用的抗體放入在96孔微量滴定板中，孔中加入100μL的標準品和樣品，并將板孵育18h。然后，將各孔洗滌5次，每孔加入0.35mL洗滌液。接著，將檢測抗體（NF-κB抗體或IL-6抗體）加入至每個孔中，并在室溫（18～25℃）下孵育1h。然后，各孔再洗滌5次。室溫下streptavidin-HRP偶聯物100μL孵化1h，各孔再洗滌。在室溫下將100μL tetramethylbenzadine 聯苯胺（TMB）各孔于黑暗中放置10min，用鋁箔覆蓋滴定板，停止反應，加入終止溶液100μL和顏色測定，以自動化微板分光光度計，設定為450nm，并且將樣品與標準進行比較。然后數據計算并通過預定的標準曲線的插值的方法獲得。

1.6 牙周學檢測[2]

PLI：表面輕劃可見菌斑計1分，表面無菌斑計0分，表面堆積大量軟垢計3分。PD：使用牙周探針在近舌、遠舌、近頰、遠頰進行檢測，探針平行于牙體長軸，緊貼牙根，用力輕柔，探針深入到齦溝底，對探針刻度進行記錄。SBI：探診未出血計0分，齦緣呈線狀出血計2分，探診有分散點狀出血計1分，齦緣內重度或自發出血計3分。

1.7 統計學處理

表1 各組患者齦溝液及牙周血指標比較

表2 各組患者種植體與健康牙齦溝液中IL-6及NF-κB含量比較（±s ，ng/mL）

表2 各組患者種植體與健康牙齦溝液中IL-6及NF-κB含量比較（±s ，ng/mL）

注：與對照組、健康種植體比較，*P＜0.05；與重度組比較，#P＜0.05

組別 亞組 IL-6 NF-κB炎癥種植體組 輕度組（n=15） 5.02±0.92*# 11.05±1.38*#中度組（n=20） 6.05±1.52*# 13.05±1.35*#重度組（n=16） 8.01±0.88* 15.32±1.35*健康種植體（n=75） 1.45±0.36 2.68±0.45對照組（n=67） 1.34±0.68 2.62±0.52 F 436.19 1662.51 P＜0.05 ＜0.05

2 結果

2.1 各組患者齦溝液及牙周血指標比較

炎癥組、對照組及健康種植體中齦溝液含量、PD、SBI、PLI，經方差分析發現有統計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較發現，炎癥組齦溝液含量、PD、SBI、PLI明顯高于對照組及健康種植體（P＜0.05），對照組及健康種植體比較無統計學意義（P＞ 0.05），見表 1。

2.2 各組患者種植體與健康牙齦溝液中IL-6及NF-κB含量比較

健康種植體、對照組及炎癥種植體組中的IL-6及NF-κB含量經方差分析顯示有統計學差異，進一步兩兩比較發現，炎癥種植組中的3個亞組齦溝液中NF-κB 、IL-6比對照組及健康種植體組的分泌水平高，且隨著病情的加重，NF-κB及IL-6水平不斷升高，見表2。

2.3 相關性分析

用Spearman法進行相關分析顯示，種植體周圍炎患者齦溝液中IL-6與NF-κB呈正相關（r=0.758，P=0.002）。

3 討論

口腔種植體的應用使常規義齒修復效果得到較大程度的提高，提高患者的口腔功能和面部美觀，得到越來越多人的認同。然而種植修復的成功率尚未達到100%，其中由宿主反應及口腔微生物感染引起的種植體周圍炎，易引起種植體周圍骨組織功能喪失，使種植體失去支撐作用，導致種植體修復失敗。種植體周圍炎是發生在種植體周圍軟硬組織的炎癥，是種植修復后常見的并發癥之一，其發生發展是類似于牙周病，是一個緩慢的不斷進展的過程。臨床上關于種植體周圍炎的發病機制目前尚不清楚，導致臨床治療難度較大。目前多數學者認為[3-5]，種植體周圍炎最主要的致病因子為微生物，微生物侵襲種植體周圍組織，進而使組織遭受破壞所致。因此對種植體周圍炎的發病機制進行深入探討，尋求種植體周圍炎各種新的治療方法已成為當前口腔種植領域關注的焦點。本研究發現，炎癥組患者齦溝液總量及PD、SBI、PLI明顯高于對照組及健康種植體，表明炎癥組種植體周圍組織受到微生物感染，引發炎癥反應，導致骨吸收和組織滲出液明顯增加。

核轉錄因子NF-κB是一種特異結合蛋白，是由美國學者Baltimore及Sen在漿細胞與B細胞中發現[6]。活化的NF-κB與靶基因結合后可對其基因轉錄進行調節并促進多種炎性介質表達。研究發現[7]，NF-κB在炎性反應、免疫應答、細胞粘附及細胞生長與凋亡等方面發揮重要作用，在非活化狀態下，NF-κB與IκB結合存在于胞質中，在外界因素刺激下，促使IκB降解、NF-κB解離，NF-κB激活后進入胞核，與特定基因的增強子或啟動子上相應位點結合，對特定基因的轉錄具有調控作用，促使一系列炎癥因子，如IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-8等的釋放，從而引起局部或全身的炎癥狀態。研究顯示[8]，NF-κB信號通路參與骨性關節炎、滑膜炎、骨質疏松、根尖周炎、牙周炎等疾病的發生發展過程。目前臨床上關于NF-κB與種植體周圍炎的研究尚處于起步階段，僅見一篇相關報道，即李巖等選取5只成年雜種犬建立口腔種植體周圍炎模型，通過ELISA方法檢測NF-κB在成年雜種犬種植體周圍炎中的表達，發現NF-κB在種植體周圍炎的齦溝液中的表達相比健康的種植體周圍齦溝液顯著增多，提示NF-κB 參與種植體周圍炎的發生、發展[9]。本實驗通過研究NF-κB在人種植體周圍炎中的表達情況，探討NF-κB在種植體周圍炎中的作用，以期為種植體周圍炎治療尋找新的靶點，結果顯示，炎癥種植體組的3個亞組齦溝液中的NF-κB 比對照組及健康種植體組的分泌水平高，且隨著病情的加重，NF-κB水平不斷升高，提示NF-κB參與種植體體周圍炎的發生發展，能夠反映齦溝液中炎癥狀態，該結論與上述文獻報道一致[10]。

IL-6主要由單核-巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞產生，其可通過自分泌或旁分泌的方式，在免疫應答、造血功能調節等方面發揮功能作用。研究還發現[11]，其在骨吸收及破骨細胞形成中均發揮著重要的作用，其還能夠上調破骨細胞中MPP-3的表達水平，使骨基質分解加速，促進骨質吸收。研究發現[12-14]，IL-6的表達與種植體周圍炎的活動期呈線性相關。本研究中發現，炎癥種植體組的3個亞組齦溝液中的IL-6表達水平比對照組及健康種植體組顯著要高，且其水平隨著病情加重而不斷升高，推測IL-6參與炎癥的發生發展，其可能通過增加種植體周圍骨質吸收，導致種植義齒治療的失敗。本研究結果顯示，IL-6、NF-KB參與種植體周圍炎的發生發展，且IL-6與NF-κB水平呈正相關，提示NF-KB作為調控基因可能在疾病發生發展中對IL-6的表達進行調控，IL-6隨著NF-KB的升高而增加。結合炎癥細胞因子對破骨細胞作用的影響，并深入研究這些因子發揮作用的信號通路，可對其信號通路進行阻斷，調控其表達，以達到控制炎癥發展的目的，從而為種植體周圍炎的臨床防治提供更好地指導[15]。

綜上所述，口腔種植體周圍炎患者齦溝液中IL-6、NF-KB水平升高，IL-6、NF-KB可能參與疾病發生發展，能夠反映炎癥程度，二者在種植體患者齦溝液中呈正相關，為臨床種植體周圍炎的防治提供新的思路。