克唑替尼治療肺癌肝毒性與CYP3A5基因多態性的相關性分析

顧鵬 王璇 周月琴

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，其中85%的患者分型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1-2]。隨著精準醫學的發展，NSCLC的治療已經進入個體化時代。2007年，科學家們發現了棘皮動物微管相關蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein-like 4/anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK)融合基因與肺癌相關，而針對EML4-ALK 融合基因靶點的小分子抑制劑克唑替尼在多項研究中被證實具有良好的臨床療效及耐受性[3-4]。

克唑替尼主要通過肝微粒體酶進行代謝，酶的代謝活性直接影響克唑替尼在體內的血藥濃度[5]。CYP3A是藥物代謝酶細胞色素P450(cytoehromeP450, CYP450)的一個亞家族，是參與藥物代謝的主要酶系，主要分布在小腸和肝[6-7]。基因變異是CYP3A5酶表達的主要調控方式，CYP3A5被認為是造成個體間CYP3A活性差異的最主要原因[8]。CYP3A5 基因具有30多個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點，但并不是所有的基因突變均可引起酶活性改變。其中CYP3A5*3突變頻率最高，攜帶突變型純合子(CYP3A5*3/*3)的個體不表達CYP3A5，CYP3A5酶失去部分功能或喪失活性，導致對底物的代謝效率下降[9]。本文選擇影響酶的催化活性的等位基因變異型——CYP3A5*3進行基因型研究，通過比較陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)新橋醫院使用克唑替尼治療肺癌患者的CYP3A5基因型差異，探討克唑替尼相關的藥物性肝損傷與CYP3A5基因多態性之間可能存在的相關性。

對象與方法

一、研究對象

選擇2013年1月至2017年12月在陸軍軍醫大學(第三軍醫大學)新橋醫院采用克唑替尼治療的84例NSCLC患者。其中男性36例，女性48例，中位年齡44.3歲，病理診斷4例為腺鱗癌，其他均為腺癌，12例為Ⅲb期，其他均為Ⅳ期。克唑替尼為一/二線治療的各占32例，三線治療20例，既往治療方案包括紫杉醇聯合鉑類，多西他賽聯合鉑類，培美曲塞二鈉聯合鉑類。以患者血清轉氨酶或膽紅素升高為表現肝毒性，分為肝毒性組32例、無肝毒性組52例，性別(男/女)分別為12/20和24/28，年齡分別為(46.85±12.34)歲和(43.98±11.61)歲，身高分別為(170.84±6.99)cm和(162.67±7.45)cm，體質量分別為(69.03±13.32)kg和(62.30±14.25)kg。兩組患者年齡、性別、身高及體質量等比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

納入標準： ①組織病理學或細胞學證據的Ⅲb期-Ⅳ期NSCLC(國際肺癌研究協會第7版NSCLC分期標準為據)；②經Ventana IHC或熒光原位雜交技術(fluorescence insitu hybridization, FISH)或RT-PCR基因檢測ALK重排融合基因陽性；③按標準劑量口服克唑替尼膠囊200～250 mg，2 次/d。排除標準：患者在服用克唑替尼之前有肝功能異常。

二、研究方法

收集患者的性別、年齡、身高、體質量等一般資料，病理類型及分期，是否肝轉移，是否有肝炎病史，服用克唑替尼的劑量、時間，以及用藥后監測肝功能的相關指標：丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase, ALT)，門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase, AST)，總膽紅素(total bilirubin, TBIL)及堿性磷酸酶(alkaline phosphates, ALP)。肝毒性按常見不良反應事件評價標準(common terminology criteria for adverse events, CTCAE)5.0版標準進行評價。肝毒性分級：1級(血清轉氨酶>正常值上限-3.0倍正常值上限；ALP>正常值上限-2.5倍正常值上限；TBIL>正常值上限-1.5倍正常值上限)；2級(血清轉氨酶>3.0～5.0倍正常值上限；ALP>2.5～5.0倍正常值上限；TBIL>1.5～3.0倍正常值上限)；3級(血清轉氨酶>5.0～20.0倍正常值上限；ALP>5.0～20.0倍正常值上限；TBIL>3.0～10.0倍正常值上限)。

抽取患者5 ml靜脈血，用PHARM-GENE 200 SNP分析樣本處理試劑(耀金分)進行DNA序列測定的分析樣本處理，用實時熒光定量 PCR 儀，型號：RT-CyclerTM 436/TL988(博奧生物科技有限公司)，進行SNP 基因型分析[10]。

三、統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件分析患者性別、年齡、身高、體重的組間差異，對無肝毒性對照樣本的CYP3A5*3基因進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，α=0.05。應用STATA 10.0 軟件進行非條件性二元Logistic 回歸分析，校正年齡、性別，計算目標SNP 基因型的優勢比(oddsratios,OR)和95%可信區間(confidence intervals,CI)。所有P值均為雙側檢驗。

結 果

一、肝功能損傷情況

84例患者中32例出現以血清轉氨酶或膽紅素或堿性磷酸酶升高為表現的肝毒性。肝毒性發生的中位時間為41 d(15～162 d)。發生1級肝功能損傷的有16例，發生2級肝功能損傷的有8例，發生3級肝功能損傷的有8例，沒有患者發生4級肝功能損傷，見表1。其中有4例肝功損傷3級患者發生了INR值(國際標準化比值)的輕度升高。在發生2級和3級肝毒性的16例患者均有再次服用小劑量克唑替尼的經歷，其中5例再次出現了克唑替尼導致的肝毒性，見表1。

表1 肝功能損傷例數分布

注：ALT-丙氨酸氨基轉移酶；AST-門冬氨酸氨基轉移酶；ALP-堿性磷酸酶；TBIL-總膽紅素；INR-國際標準化比值

二、CYP3A5多態性基因分型情況

不同種族間CYP3A5的變異率有所不同，其中CYP3A5*3 在白種人的突變頻率為77.6%，在黑種人的突變頻率為70.6%，而在中國人、日本人中的突變頻率分別為71%～76%、71%～85%[11]。本實驗中，CYP3A5*3的基因突變頻率為78.57%，與文獻報道相符。無肝毒性對照組通過了Hardy-Weinberg平衡檢驗(P=0.837)，見表2。

表2 各組間CYP3A5*3基因型

注：GG-野生純合型；GA-突變雜合型；AA-突變純合型

三、相關性分析

經非條件性二元Logistic 回歸分析，在定義的共顯性和顯性遺傳模型下，發現CYP3A5*3突變與克唑替尼肝毒性的發生無顯著性關聯，見表3。

表3 CYP3A5*3基因型與克唑替尼肝毒性的

注：a-全局性P值(df=2)：肝毒性組與非肝毒性組基因型頻率比較的χ2檢驗；b-非條件Logistic回歸分析P值(校正年齡和性別)；c-由于缺少基因型數據無法進行計算

討 論

抗腫瘤藥物的研發與上市十分迅速，特別是針對信號通路分子靶點的抗腫瘤藥物的開發已成為重點領域。與傳統的細胞毒性抗腫瘤藥物相比，以細胞信號轉導分子為靶點的抗腫瘤藥物具有更高的抑瘤效率和更低的毒副作用，但仍存在不同程度的脫靶效應。研究顯示，在藥物安全性評價中失敗以及從藥品市場上撤銷的藥物中，超過一半以上的原因是由肝臟毒性導致的，抗腫瘤藥物的肝臟毒性值得關注。

酪氨酸激酶抑制劑是一類新型的靶點抗腫瘤藥，其基本作用原理是通過與競爭性結合細胞外的配體結合位點，阻斷酪氨酸激酶的活化，抑制受體的激活，從而達到抑制腫瘤的惡性增殖以及促進腫瘤細胞凋亡。隨著上市后臨床使用時間的延長以及患者人群的擴大，該類藥物的毒性被逐漸報道，包括心臟毒性、骨髓毒性、肺毒性等等，其中肝臟毒性是該類藥物不良反應率較高的一種。研究顯示，達沙替尼等藥物肝毒性報道率最高藥物化學結構中，都存在“邁克爾反應受體結構”，能夠共價結合并消耗細胞內谷胱甘肽，從而破壞肝臟的氧化應激體系。再者酪氨酸激酶類都是口服藥物，胃腸道吸收后會經過腸系膜血管進入門靜脈系統經過肝臟，在肝臟蓄積，以上結果無疑提示這些藥物極易破壞肝細胞內的氧化還原的平衡，引起氧化應激，損傷肝細胞。

克唑替尼是酪氨酸激酶抑制劑的一種，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗中顯示有10%～38%的患者出現轉氨酶升高，中國患者較高加索人種轉氨酶升高更多見[12-15]。酪氨酸激酶的肝臟毒性作用除了與細胞應激、免疫反應相關外，近年來也認為與藥物代謝酶CYP450的基因多態性有關[16-18]。克唑替尼主要通過CYP3A的途徑代謝，亦是CYP3A的抑制劑[19-23]。劑量依賴性細胞毒性機制和免疫過敏機制都在小分子化合物所致肝毒性中被提及[24-27]。然而，哪種機制占主導地位要取決于個體。前一種機制可能在服用小劑量克唑替尼安全的人群中占主導地位。后一種機制可能在服用小劑量克唑替尼仍然導致肝毒性的人群中占主導地位。不管是哪種機制，在肝內未代謝的激活型克唑替尼和其具有生物活性的代謝物，可能是其所致肝毒性的決定性因素。

CYP3A5基因多態性會對克唑替尼所致肝毒性有影響這種假設，在本研究中沒有被證實，發現攜帶CYP3A5*1(表達CYP3A5)的患者與攜帶CYP3A5*3/*3(不表達CYP3A5)的患者其發生肝毒性的風險沒有顯著性差異。然而有趣的是，在本研究中，發生2級和3級肝毒性的患者中有6例同時服用了CYP3A4抑制劑，且接受克唑替尼的小劑量再次給藥(250 mg，1次/d)后，具有*3/*3的5例再次發生了克唑替尼導致的肝毒性。即同時服用CYP3A4抑制劑且具有*3/*3的患者，在再次小劑量使用克唑替尼時都會發生肝毒性，這種肝毒性在服用CYP3A4抑制劑且不具有*3/*3的患者中沒有發生。上述發現使本研究不能完全排除服用克唑替尼導致肝毒性與CYP3A5的活性降低有關。所以，如果患者因遺傳因素導致了CYP3A5活性降低，在CYP3A4功能因聯合用藥而受到影響時，CYP3A5活性降低會使克唑替尼代謝不足，蓄積在體內，導致肝毒性。此外，大多數CYP3A4抑制劑都是P-糖蛋白抑制劑。在本研究的聯合用藥中，氨氯地平不是P-糖蛋白抑制劑，硝苯地平和地爾硫也不是P-糖蛋白抑制劑。這從一定程度上排除了P-糖蛋白對克唑替尼造成影響的可能性。

本研究仍然有一些不足。因為這是一項回顧性分析，部分患者在入組時已經停止使用克唑替尼，所以沒有藥動學/藥效學的研究。另外，由于肝損傷患者進行肝穿刺活檢較少，沒有通過檢測肝活檢標本來對藥物在肝臟內的濃度和CYP酶的活性進行測定。克唑替尼所致肝毒性的機制期望在將來的前瞻性研究中進一步明確。CYP3A5活性降低雖然不能直接預示克唑替尼肝毒性的發生，但存在一定相關性。克唑替尼個體代謝不同，包括聯合用藥和免疫過敏機制對克唑替尼和/或其代謝物的影響，這些復雜的因素綜合導致了其肝毒性的產生[28-31]。在CYP3A5活性降低的患者中，應盡量避免使用CYP3A4抑制劑。相信更多的研究將會進一步闡明克唑替尼肝毒性的機制，使患者能更好的避免藥物相關不良反應的發生，使臨床用藥更加合理、安全、有效。