沉默F(xiàn)GF4表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制

曲杰，魏依蘭，梁云薇，呂喜英，李青山

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000)

2012年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年大約有167萬女性被確診為乳腺癌，死亡人數(shù)接近52萬[1]。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年升高，并呈年輕化趨勢。盡管目前在乳腺癌的診斷和治療上取得了很大進(jìn)展[2，3]，但對其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)是參與血管生成、傷口愈合、胚胎發(fā)育及各種內(nèi)分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一類生長因子。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF及其受體(FGFR)組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[4]。成纖維細(xì)胞生長因子4(FGF4)是FGF家族中的成員之一，是許多間充質(zhì)和神經(jīng)外胚層起源細(xì)胞的促分裂素，在胚胎生長、發(fā)育及血管形成等多種生理過程中具有重要作用[5]。但目前鮮見FGF4對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的報(bào)道。2014～2017年，我們觀察了沉默F(xiàn)GF4表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(以下稱MCF-7細(xì)胞)，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫。siRNA序列5′-CGAUGAGUGCACGUUCAAGDTDT-3′、陰性對照序列5′-AACGGAGTATCTGCACGTGDTDT-3′，由華大基因科技有限公司合成。流式細(xì)胞儀，美國BD公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、鼠抗人第二抗體，美國Invitrogen公司；FGF4單克隆抗體，美國Sigma公司；cyclin D1、caspase-3單克隆抗體，美國Abcam公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、全細(xì)胞蛋白抽提試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取傳2代對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MCF-7細(xì)胞FGF4沉默及效果驗(yàn)證 ①細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取傳2代對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，用無血清的DMEM完全培養(yǎng)液重懸，制成密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1 mL接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隨機(jī)分為FGF4沉默組、陰性對照組、空白對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞融合40%～60%時(shí)，F(xiàn)GF4沉默組、陰性對照組按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明分別轉(zhuǎn)染siRNA、陰性對照序列，空白對照組不予轉(zhuǎn)染。各組轉(zhuǎn)染6 h，更換新的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。②轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證：采用Western blotting法。收集各組再培養(yǎng)48 h細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE(5%濃縮膠、12%分離膠)分離蛋白，以80 V電壓進(jìn)行濃縮膠跑樣，待電泳條帶跑出濃縮膠并進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出分離膠最下端時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入鼠抗人FGF4單克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室中顯影、定影。采用Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF4沉默組FGF4蛋白相對表達(dá)量為2.35±0.19，陰性對照組為9.73±0.46，空白對照組為9.56±0.53，F(xiàn)GF4沉默組FGF4蛋白相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。說明siRNA序列能夠抑制MCF-7細(xì)胞FGF4蛋白表達(dá)。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 細(xì)胞增殖能力 采用MTT法。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，用無血清的DMEM完全培養(yǎng)液重懸，制成密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h；小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO 200 μL，微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD490值/對照孔OD490值)×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸，制成密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液500 μL，置于流式管中，然后加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，混勻，室溫避光孵育5～15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀自動(dòng)檢測早期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 cyclin D1、caspase-3蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE(5%濃縮膠、12%分離膠)分離蛋白，以80 V電壓進(jìn)行濃縮膠跑樣，待電泳條帶跑出濃縮膠并進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出分離膠最下端時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入cyclin D1、caspase-3單克隆抗體(1∶500)和抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室中顯影、定影。采用Quantity One軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與空白對照組同時(shí)間比較，*P<0.05；與陰性對照組同時(shí)間比較，#P<0.05；與同組培養(yǎng)24 h比較，△P<0.05；與同組培養(yǎng)48 h比較，▽P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞早期凋亡率比較 空白對照組、陰性對照組、FGF4沉默組早期凋亡率分別為(2.76±0.04)%、(2.84±0.07)%、(5.79±0.09)%。與陰性對照組和空白對照組比較，F(xiàn)GF4沉默組早期凋亡率明顯升高(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。

2.3 各組cyclin D1、caspase-3蛋白表達(dá)比較 與陰性對照組和空白對照組比較，F(xiàn)GF4沉默組cyclin D1蛋白相對表達(dá)量明顯降低，caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組cyclin D1、caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較P均>0.05。見表2。

表2 各組cyclin D1、caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

3 討論

FGF家族是一個(gè)多基因家族，到目前為止至少擁有23個(gè)家族成員，其家族成員存在于從線蟲到人類的所有生物體內(nèi)[6]。FGF家族成員FGF4、FGF9、FGF18等均為wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的直接下游靶基因[7～9]，而wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。目前已有研究證實(shí)，F(xiàn)GF4可作為癌基因，促進(jìn)纖維瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10～12]。但其是否參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展尚不清楚。

本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默MCF-7細(xì)胞FGF4表達(dá)，并觀察沉默F(xiàn)GF4表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF4沉默組轉(zhuǎn)染后再培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于陰性對照組和空白對照組，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF4沉默組早期凋亡率明顯高于陰性對照組和空白對照組，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，F(xiàn)GF4基因可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起促癌基因作用；特異性干擾FGF4表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

惡性腫瘤最主要的特征是無限增殖，即腫瘤細(xì)胞具有永生化特征，而腫瘤細(xì)胞永生時(shí)細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞增殖體系不受控制。cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)特異性結(jié)合形成cyclinD1-CDK復(fù)合物，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖能力[13]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GF4沉默組cyclin D1蛋白相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默F(xiàn)GF4表達(dá)后MCF-7細(xì)胞增殖能力降低，其原因可能與cyclin D1蛋白表達(dá)降低有關(guān)。腫瘤細(xì)胞凋亡主要有三個(gè)途徑，即細(xì)胞外死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[14]。在這三條途徑中半胱氨酸蛋白酶caspase家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF4沉默組caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯高于陰性對照組和空白對照組，而空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默F(xiàn)GF4表達(dá)后MCF-7細(xì)胞凋亡增多可能與激活caspase-3參與的凋亡信號通路有關(guān)。

綜上所述，沉默F(xiàn)GF4表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能為抑制cyclin D1、促進(jìn)caspase-3蛋白表達(dá)。但乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，F(xiàn)GF4調(diào)節(jié)下游靶基因cyclin D1、caspase-3表達(dá)的具體信號通路還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。