基于微流控紙芯片的病原體檢測方法研究進展

王丹丹(WANG Dan-dan), 鄭國俠(ZHENG Guo-xia), 王云華(WANG Yun-hua)

(1 大連大學醫學院，遼寧 大連 116622； 2 大連大學環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622)

病原體的快速檢測和準確鑒定在臨床實驗室檢測、食品工業和環境監測方面至關重要，現有的細菌培養、核酸擴增和酶聯免疫等病原體診斷方法或耗時費力，或需要復雜的儀器設備，不適合現場即時檢測，因此，目前亟需一種快速有效檢測病原體的新方法。

微流控紙芯片逐漸成為檢測病原體感染的新工具，紙基微流控芯片(paper-based microfluidics)或微流控紙基分析設備(microfluidic paper-based analytical device, μPADs)簡稱紙芯片，是由Martinez等[1]在2007年首次提出，其用紙張作為基底代替硅、玻璃、高聚物等材料，在紙上加工出具有一定結構的親疏水微細通道網絡及相關分析器件，構建“紙上微型實驗室”，可用于尿、唾液、血等多種物質的分析與檢測，為早期診斷和早期治療提供了平臺。紙芯片成本低，制作簡單，攜帶方便，可在現場采樣并迅速檢測分析，實現真正意義上的即時檢測(point-of-care testing，POCT)。本文旨在介紹微流控紙芯片的病原體檢測方法和紙芯片微流控技術的發展前景。

目前，紙芯片應用研究主要集中于醫學、生物學和環境監測[2]，根據檢測原理可以把紙芯片病原體檢測分為四類：比色檢測、熒光檢測、化學發光檢測和電化學發光檢測。

1 基于比色檢測法的微流控紙芯片

比色檢測法是目前紙芯片分析研究中最常見的檢測方法，通過顯色反應使待檢測組分轉化為有顏色的物質，這種檢測既可直接通過肉眼辨別實現定性檢測，也可采用數碼相機或智能手機拍照、掃描儀掃描成圖像，利用顏色深度與待測組分濃度的相關性來實現半定量或定量檢測。比色檢測根據標記物的不同可分為紙基-酶聯免疫吸附實驗(P-ELISA)、膠體金相關紙芯片、其他比色法紙芯片。

1.1 P-ELISA P-ELISA將ELISA的靈敏性和特異性與低成本、易使用的紙張平臺相結合，在紙上制作96微孔板進行檢測。早在2010年，Cheng等[3]首次用P-ELISA方法檢測血清樣品中的人類免疫缺陷病毒，研究表明P-ELISA比傳統ELISA法更快更便宜，但靈敏度稍差。隨著檢驗技術的進步，目前P-ELISA不僅縮短了時間，而且提高了靈敏度。Khan等[4]利用P-ELISA檢測T 7噬菌體，可在30 min內得出檢測結果，檢測范圍為100～109PFU/mL，而傳統ELISA法檢測時間多達幾小時，檢測范圍為2×105～2×107PFU/mL。Larsson等[5]在改進的濾紙上檢測M13噬菌體，其中聚電解質多層(PEM)由丙烯酸(PAA)和烯丙胺鹽酸鹽(PAH)組成，有利于病毒的靜電吸附，該方法的檢測時間<2 h，檢測限可達到5×104PFU/mL，而傳統夾心ELISA法檢測時間至少3～4 h，檢測限為107PFU/mL。

紙芯片在酶聯免疫方面的改進不僅體現在縮短檢測時間和提高檢測靈敏度，還體現在簡化操作步驟并實現了自動化控制。Sanjay等[6]開發了一種簡單的小型化紙/PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)混合微流控微孔板，用于在不發達地區定量檢測免疫球蛋白G(IgG)和乙肝表面抗原(HBsAg)，該方法使用流通微孔中的多孔紙，有助于抗體/抗原固定化和有效洗滌，紙張表面不需其他化學修飾，此外，頂端試劑輸送通道可以簡單地將試劑轉移至多個微孔中，避免重復的手動移液或使用昂貴的機器人，實現自動化控制。

1.2 膠體金相關紙芯片 膠體金是金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液，在病原體檢測中常作為示蹤標記物或顯色劑。Lei等[7]在紙芯片上通過膠體金標記抗體實現對甲型H1N1和H3N2流感病毒的檢測和亞型分析，紙張經殼聚糖修飾，在反應中加入金增強(GE)試劑，使得每個檢測區域只需加入5 μL樣品即可在1 h內完成流感病毒檢測，檢測限H1N1為2.7×103PFU/mL，H3N2為2.7×104PFU/mL，在臨床檢測中要達到相同檢測限的RT-PCR法耗時6 h。另外，該方法可從感染細胞的裂解物和臨床樣品中檢測流感病毒，進一步證實了基于紙張的免疫測定的可靠性。

膠體金免疫層析法在紙芯片病原體檢測中有很多研究。Fu等[8]介紹了一種全自動擴增的二維紙網絡測定法，該方法用來檢測瘧疾蛋白PfHRP2，其紙芯片能夠實現膠體金信號放大，試劑與樣品同步輸送，檢測限為(2.9±1.2)ng/mL，是未用信號放大試劑(10.4±4.4)ng/mL的1/4，與傳統ELISA法的檢測限相當。Khan等[9]利用抗體偶聯金納米顆粒檢測霍亂毒素，根據吸光度比(A605/A523)的變化對霍亂毒素濃度進行定量分析，利用動態光散射(DLS)測量金納米顆粒的大小，確認比色法的結果。另外，金顆粒的聚集導致可見的顏色變化，實現目測霍亂毒素濃度低至10 nmol/L，低于先前報道的比色法的目測濃度(54 nmol/L)[10]。

膠體金標記的核酸雜交技術與紙芯片結合提供了新的病原體檢測平臺。以結核分枝桿菌檢測為例，Veigas等[11]將膠體金探針與特定DNA靶序列雜交，通過減少膠體金顆粒的偶聯使顏色保持紅色，從而區分靶序列與非互補序列。該芯片將這種比色測定法整合到384微孔板上，用智能手機量化紙的顏色變化，將數據傳輸至異地進行處理，可在2 h內篩選結核分枝桿菌的核酸分子，每個檢測加樣量為5 μL，少于在塑料材質上15 μL的加樣量，但經巰基修飾的ssDNA序列通過Au-S鍵形成的膠體金探針制備過程需專業人員操作且耗時長。因此，Tsai等[12]通過未修飾的金納米顆粒和單鏈寡核苷酸雜交實現快速診斷，利用鹽誘導的膠體金溶液檢測結核分枝桿菌的DNA序列，不需要多個PCR循環擴增特異性DNA靶序列，無需復雜且耗時的硫醇化或其他表面修飾的制備探針的過程，制作方法簡單快捷，該設計可以檢測到濃度為2.6 nmol/L的結核分枝桿菌靶序列，檢測時間約為1 h，低于傳統檢測方法(痰涂片鏡檢、結核分枝桿菌培養和分子種類診斷)的檢測時間。

1.3 其他比色法紙芯片 除了P-ELISA、膠體金相關紙芯片之外，還有用其他比色法檢測病原體的紙芯片。Murdock等[13]在不同的緩沖液條件下，基于紙張平臺進行酶底物反應，通過顏色變化定性檢測甲型和乙型流感病毒，通過觀察樣品是否受抗病毒藥物(如達菲)的影響，實現了同步檢測流感病毒的耐藥性。Jokerst等[14]在濾紙上檢測食品樣品中的大腸埃希菌O157∶H7、單核細胞增多性李斯特菌和鼠傷寒沙門菌，利用物種特異性酶與底物的相互作用，由不同顏色變化確定三種病原菌的存在，8～12 h內可檢測濃度為10 CFU/cm2的致病菌，低于文獻[15]報道的最低限值(100 CFU/cm2)，而檢測食源性細菌的金標準細菌培養法需要耗時5～7 d，因此該設計為準確簡便地檢測多種病原菌提供了可能。

2 基于熒光檢測法的微流控紙芯片

熒光檢測法的原理是基于蛋白質、DNA以及氨基酸等生化樣品本身有熒光，或者可以用熒光試劑標記，激光誘導熒光進行測定，熒光強度與入射光強度、量子效率、樣品濃度成正比。在微流控紙芯片檢測中，熒光檢測法的靈敏度高于比色檢測法。Cho等[16]通過角度特異性米氏散射量化免疫凝集的程度，用智能手機檢測綠色熒光信號，在紙芯片上實現病原菌的免疫凝集檢測，總測定時間<30 s，該研究中大腸埃希菌K12和淋病奈瑟球菌的檢出限均為10 CFU/ mL，低于市售的淋病快速試劑盒檢出限(106CFU/mL)和大腸埃希菌檢測條(亞硝酸鹽檢測條)的檢出限(106CFU/mL)。Miranda等[17]用熒光標記的多克隆抗體作為識別器早期診斷大豆銹病，該免疫傳感器具有高度特異性和敏感性，檢測時間明顯少于ELISA和PCR法，檢測限低至2.2 ng/mL，與ELISA和PCR檢測方法的檢測限相當，是免疫層析法的1/100。

將紙(或膜)提前用融合蛋白處理比將抗體直接包被在紙(或膜)上的靈敏度高。Rosa等[18]介紹了將具有融合蛋白的抗體錨定在紙上捕獲熒光素標記的DNA鏈和雜交體的方法，其中碳水化合物結合模塊(CMB)與葡萄球菌蛋白A的ZZ片段形成CBM-ZZ構建體，通過識別IgG抗體的Fc段，促進纖維素紙固定蛋白，該芯片可以檢測ESAT-6(一種編碼來自結核分枝桿菌分泌蛋白的基因)的寡核苷酸序列。

Funes-Huacca等[19]將紙張、膠帶與透氧不透水的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜相結合制出一款紙芯片，該芯片模擬細菌的生長環境，使用平板掃描儀或手機相機量化具有熒光標記的細菌增殖，該方法大腸埃希菌的檢測限低至1～10 CFU/100 μL，可用于不發達地區的現場測試和農場中動物健康測試等。Lo等[20]通過使用商業化的熒光探針(標記雙鏈DNA)與DNA相結合，在紙張上檢測登革熱，對紙芯片上的熒光環介導逆轉錄等溫擴增(RT-LAMP)產物進行量化分析，為開發基于紙芯片的體外早期登革熱診斷裝置提供了依據。

Kurdekar等[21]開發基于碳量子點的免疫紙芯片用于快速檢測HIV-1 p24抗原，碳量子點在光激發下自發熒光，光學穩定性強，與有機熒光體相比，量子點具有簡單、便宜、抗漂白及低毒等特點，將制作簡單的紙芯片與高度特異的碳量子點相結合，用于早期HIV感染的快速篩查。

3 基于化學發光檢測法的微流控紙芯片

化學發光是根據化學反應在某個時刻發射的光強度來確定反應中某一組分濃度的方法，不需任何外加光源。化學發光檢測法可以與紙芯片相組合，建立廉價和高敏感的新型化學發光生物傳感器。Wang[22]用N, N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)制備DNA傳感器，將傳感器共價固定在紙芯片上捕獲DNA，核酸雜交反應后，在DNA生物傳感器上捕獲碳量子點標記的DNA信號，高錳酸鉀將空穴注入到碳點中，高能帶中的電子與氧化劑注入空穴湮滅產生化學發光信號，最終通過分析化學發光信號的強度定量檢測目標DNA，該方法靈敏度可達到8.56×10-19mol/L，但超弱發光分析儀檢測器價格昂貴，不適合現場即時檢測。Liu等[23]首先提出了電荷藕合器件(CCD)傳感器與紙芯片化學發光檢測的綜合應用，開發了一種新型的紙基微流體化學發光DNA生物傳感器，通過DNA探針和生物素標記的DNA鏈的雜交反應檢測李斯特菌的DNA片段，使用低成本的CCD成像裝置作為檢測器檢測發光信號，該方法所提供的DNA生物傳感器分析性能好，且有助于在紙芯片上實現簡單、低成本和便攜式的化學發光檢測，其檢測范圍為1.94×10-1～1.94×104pmol/L，檢測限為6.3×10-2pmol/L，檢測限比具有CCD檢測器的其他微流控電化學DNA測定的檢測限低3～5個數量級。

4 基于電化學發光檢測法的微流控紙芯片

電化學發光法是在化學發光和電化學基礎上發展起來的一種新的分析方法，是通過電驅動促使某些物質發生電化學反應形成激發態，并通過輻射光子返回基態，并對發光強度進行測量的一種分析方法，與化學發光傳感器相比，電化學發光生物傳感器背景信號低、分析物范圍廣、靈敏度高、利于實現多重檢測，減少樣品消耗，提高空間分辨率，降低操作復雜度，縮短測定時間，提高樣品通量[24-25]。Feng等[26]制造了IA型一次性紙基還原雙極電極(BPE)陣列檢測多種病原體DNA，組裝在BPE陰極上的發夾結構DNA與互補靶DNA結合，與鉑納米顆粒(PtNPs)標記的探針DNA雜交，經PtNPs催化的氧氣被還原產生電化學發光信號，這種基于紙張的BPE陣列傳感器實現了對梅毒螺旋體基因、免疫缺陷病毒基因和乙型肝炎病毒基因的多重分析。

5 結語

紙芯片制作簡單，便攜性好，樣品用量少，成本低及易集成化等，其研究及應用日益受到關注。基于比色法檢測的紙芯片易于操作并可直接讀出信號，是最常見的檢測手段，但其應用常受到低靈敏度的限制；熒光檢測較比色法具有更高的靈敏度[18, 27]，但存在嚴重背景熒光和紙的光散射問題，使測定很難直接在紙芯片上進行。化學發光法不需外加光源，靈敏度較高，儀器設備簡單，易于實現微型化和集成化，但需黑暗的檢測環境，且大多數檢測器價格昂貴，尋求低成本的檢測器依舊是研究的關鍵。電化學發光方法簡單，靈敏度高，易于定量，環境光獨立以及紙張干擾低等，逐步被應用于紙芯片，但電化學發光紙芯片幾乎所有現有器件都需要昂貴的恒電位儀，將電極添加到檢測區域會增加復雜性和每次測試的成本，發展基于紙芯片平臺的低成本的檢測設備和紙芯片制備方法是該領域的重要研究方向。見表1。

表1 四種微流控紙芯片檢測方法的特點

近幾年紙芯片的研究逐年增加，但其商業化過程依然存在較多問題。現有研究中經常忽視不同測試條件(如溫度、濕度、環境光、樣品基質的復雜度)下的性能分析，而這些對紙芯片的現場即時檢測非常重要，該方法的穩定性和干擾因素研究是推動病原體檢測紙芯片發展的關鍵問題之一。紙芯片作為一種微全分析系統，其在樣品的分離、富集、反應、檢測方面的功能并不是很完備，尤其對于復雜多體系的組分很難實現同步檢測，研發紙芯片同步相應檢測方法，實現對復雜多體系組分的檢測也是日后的研究方向。為了改善紙芯片的分析性能，往往涉及到多種化學試劑的使用和多步預處理操作，這增加了檢測流程的復雜性，實現檢測流程標準化也是研究的一個方向。

Kumar等[28]的報告闡述了目前紙芯片發展大多停留在實驗室研究階段，少有紙芯片真正應用于現場即時檢測。因此，隨著該領域的快速發展，我們通過運用各種技術手段，著力于紙芯片的實際應用，使得未來紙芯片的發展擁有更大的影響力。