RhBMP-2通過抑制PI3K/Akt信號通路對肝細胞癌SK-Hep-1細胞增殖影響的體外研究

劉書中，錢 列，馮 帆，劉祖德，沈洪興，王以朋，勞立峰*

(1.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院 骨科,上海200127；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京100730)

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的成員，具有廣泛生物學作用。Urist等在1965年首次發現骨形態發生蛋白，至今已發現30多種BMPs，其中BMP-2、4含量占BMPs的92%且與腫瘤發生關系最為密切[1,2]。BMP-2作為超家族中的一員在調節細胞增殖、趨化、分化、凋亡和細胞外基質重建等生物學行為上發揮重要作用，多項研究顯示BMPs信號通路可參與腫瘤的發生與進展[3-5]。磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路是細胞內重要的信號傳遞途徑，參與調控細胞增殖、分化、遷移及凋亡等多種重要生物學行為[6]。磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路是參與調控細胞增殖、分化、遷移及凋亡等多種重要生物學行為的重要信號通路[6]。AKT是PI3K/AKT信號轉導通路中的關鍵分子，其磷酸化功能能夠使多種底物被活化，進而發揮相應的細胞生物學調控作用[6]。

美國FDA已批準將重組人骨形態發生蛋白-2(rhBMP-2)用于脊柱融合手術及骨不連等骨科疾患的治療，但近年來國內外多項研究表明rhBMP-2的臨床應用可增加多種惡性腫瘤的患病風險[4,5,7,8]。本研究選用肝細胞癌SK-Hep-1細胞系作為實驗對象，探討體外條件下rhBMP-2對肝癌SK-Hep-1細胞增殖能力的作用及其可能機制，為rhBMP-2應用于骨科疾病臨床治療并預防腫瘤發生發展提供一定的基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

RhBMP-2，來自UCLA骨科實驗室(加州，美國)；人肝細胞癌細胞系SK-Hep-1，來自上海市腫瘤研究所(上海，中國)；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養基及胰蛋白酶均購自Gibco，其他細胞培養相關試劑均為Gibco產品；RT-PCR相關試劑、DNA Marker、TRIzol、Western blot所用試劑等均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 肝細胞癌SK-Hep-1細胞于含慶大霉素100 U/ml、10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃、含5% CO2的細胞培養箱中常規培養，培養液每2-3天更換一次。所有實驗均用對數生長期的細胞。

1.2.2MTT細胞增殖試驗 取上述培養的肝癌SK-Hep-1細胞用2.5 mL/L胰蛋白酶消化，新鮮的培養液吹打下制成細胞懸液，用血球計數板計數，并調整細胞濃度到1×108cells/L，按照2×105cells/well SK-Hep-1細胞接種在96孔板中過夜，在無血清條件下，第2日加入不同濃度rhBMP-2處理，rhBMP-2濃度分別為0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L。分別培養24 h后，于倒置顯微鏡下觀察。MTT試劑及二甲亞砜(100 μl/well)按照用法要求加入，將96孔板置于微量振蕩器上搖震5 min，搖震過程避光進行。震蕩結束后采用分光光度計進行檢測，讀取490 nm波長處吸光度值。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞周期 取前述培養液中的肝癌SK-Hep-1細胞，制成單細胞懸液，接種于新鮮細胞培養液中，調整細胞濃度為1×106/L，接種于超低黏附6孔板中，每孔1 ml。SK-Hep-1細胞于無血清條件下培養24 h后，各孔分別加入rhBMP-2 0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L，對照組加入等體積的溶劑二甲亞砜。 藥物干預24 h后，用PBS液洗滌細胞并在37℃條件下加入5 μl AnnexinV-FITC及5 μl Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期、增殖及凋亡情況，具體操作方法按照說明書進行。

1.2.4Western blot檢測 取肝癌SK-Hep-1細胞制成單細胞懸液，接種于新鮮細胞培養液中，調整細胞濃度為3×105/L接種于超低黏附6孔板中，每孔1 ml。于對數生長期分別收集細胞，進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉印，SK-Hep-1細胞于無血清條件下分別加入rhBMP-2 0 μg/L(未加入rhBMP-2)、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L，以p21、Cyclin E、PI3K/p85α、p-AKT(1∶250稀釋)，AKT(1∶1 000稀釋)及Actin(1∶1 000稀釋)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶標記的抗體，孵育后使用ECL發光試劑盒暗室發光、顯影、定影，進行熒光掃描并用軟件Image-Pro Plus 6.0對蛋白質水平進行分析，按試劑盒說明書操作。

1.2.5RT-PCR檢測 檢測肝細胞癌SK-Hep-1細胞的增殖基因及mRNA表達水平，將SK-Hep-1細胞接種于6孔培養皿中，加入上述不同濃度(0 μg/L、0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L)的rhBMP-2處理，并培養24小時。使用TRIzol試劑法分離提取出總RNA，以其為模板，通過逆轉錄酶合成cDNA，應用qRT-PCR技術定量合成mRNA。RT-PCR檢測使用7300 RT-PCR儀完成，使用2-ΔΔCt法計算感興趣區/GAPDH表達的mRNA。所有檢測過程均在儀器使用說明書指導下完成。

1.2.6統計學分析 數據處理和統計分析采用SPSS 17.0完成，數據采用均數±標準差的表示方法。t檢驗比較組間差異，P<0.05為具有顯著統計學差異。

2 結果

2.1不同濃度及作用時間rhBMP-2對肝癌SK-Hep-1細胞增殖的影響

2.1.1無血清條件下，不同濃度的rhBMP-2處理細胞48小時，通過MTT法檢測rhBMP-2對細胞增殖能力的影響，研究發現較高濃度的rhBMP-2可抑制肝癌細胞系SK-Hep-1的增殖能力，1 μg/L，10 μg/L處理組與對照組相比，均存在統計學差異(P<0.05)(圖1)。

2.1.2無血清條件下，10 μg/L的rhBMP-2處理細胞不同時間，通過MTT檢測rhBMP-2對細胞增殖能力的影響，實驗結果發現48小時后，rhBMP-2顯著抑制SK-Hep-1細胞的增殖能力，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.2rhBMP-2對肝癌SK-Hep-1細胞周期的影響

2.2.1無血清條件下，10 μg/L的rhBMP-2處理細胞48小時，通過流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示rhBMP-2可影響細胞周期，增加處于G1期和S期SK-Hep-1細胞所占的比率(圖3)。

2.2.2不同濃度的rhBMP-2處理細胞48小時，通過Real-time PCR檢測不同濃度梯度的rhBMP-2對p21、cyclin E mRNA表達的影響，研究發現rhBMP-2可顯著促進p21 mRNA的表達，顯著抑制cyclin E mRNA的表達，并且其作用強弱具有一定的濃度依賴性(圖4)。

圖1不同濃度rhBMP-2對SK-Hep-1細胞增殖的影響圖2不同作用時間rhBMP-2對SK-Hep-1細胞增殖的影響圖3不同濃度rhBMP-2對SK-Hep-1細胞周期的影響圖4不同濃度rhBMP-2對SK-Hep-1細胞周期蛋白p21,cyclinEmRNA表達的影響

2.2.3不同濃度的rhBMP-2處理細胞24小時，通過Western blot檢測不同濃度的rhBMP-2對p21、cyclin E蛋白表達水平的影響，發現rhBMP-2可顯著促進p21的表達，顯著抑制cyclin E的表達(圖5)。

2.3不同濃度的rhBMP-2對肝癌SK-Hep-1細胞系PI3K/Akt磷酸化水平的影響

不同濃度的rhBMP-2處理SK-Hep-1細胞48小時，通過Western blot檢測rhBMP-2對p21、cyclin E蛋白水平的影響，結果顯示rhBMP-2可顯著促進p21的表達，顯著抑制cyclin E的表達；通過Western blot檢測不同濃度的rhBMP-2對PI3K/AKT磷酸化水平的影響，發現rhBMP-2可顯著抑制PI3K/AKT的磷酸化，且具有一定的濃度依賴性(圖5)。

3 討論

重組人骨形態發生蛋白-2是一種具有高效促進骨生成作用的細胞因子，此外尚可發揮包括調節胚胎發生、骨骼形態發生、發育、血管生成和腫瘤發生等多種關鍵生物學作用[4,5,7,8]。自2002年美國FDA批準將rhBMP-2用于臨床治療后，其顯著促進骨質形成的作用得到國際上的廣泛認可[9]。迄今，rhBMP-2憑借其強大的誘導骨生成的特性已廣泛用于骨折后骨不連和脊柱融合手術當中。然而，多項體外和在體試驗證明腫瘤細胞BMP-2受體的存在，并且發現rhBMP-2具有促進某些腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和轉移的潛能[4,5,7,8]。近年來，國內外多項研究提出rhBMP-2的臨床應用可能增加多種惡性腫瘤的患病風險，并可引起諸如逆行射精、脊髓神經根炎、異位骨化、局部組織腫脹等嚴重不良反應[10-13]。以上因素使BMP-2在脊柱融合手術及骨不連愈合治療中的應用面臨極大地限制和挑戰。正因如此，國際上需要更多的基礎與臨床研究來充分評估rhBMP-2的臨床應用風險。Skovrlj等[14]回顧性分析了rhBMP-2與腫瘤關聯性的相關文獻，提出rhBMP-2的臨床應用并未顯著增加患者惡性腫瘤的患病風險，但需要更多深入的體內與體外研究予以進一步證實。

圖5 不同濃度rhBMP-2對SK-Hep-1細胞周期蛋白p21,cyclin E表達及其對PI3K/Akt磷酸化水平的影響

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界最常見的癌癥中位列第五位，既往研究表明BMP-4，BMP-7和BMP-9的異常表達與HCC的腫瘤發生及進展相關，但針對BMP-2對HCC細胞的生物學影響尚缺乏相關的研究報道[15-18]。外科醫生希望將rhBMP-2的臨床使用拓寬至腫瘤切除手術所致的骨缺損、骨轉移癌及脊柱不穩定等治療領域。實現上述應用的前提條件是在手術中使用rhBMP-2不會增加惡性腫瘤的患病風險。盡管多項研究已表明rhBMP-2在多種人類癌細胞系中表達并證實具有促進或抑制腫瘤細胞生長、增殖、分化、侵襲、轉移及凋亡的作用，rhBMP-2在肝細胞癌及轉移性肝細胞癌的發生、發展中的作用尚未被完全闡明。因此，需要進行臨床前研究來評估rhBMP-2對使用者的腫瘤發生及生長的影響及其可能機制。Zheng等[19]率先研究了外源性BMP-2對肝細胞癌細胞系SK-Hep-1、Hep G2和Hep 3B細胞生長的影響，結果表明BMP-2可能通過調控PI3K/AKT信號傳導通路對肝癌細胞的生長和遷移產生影響。Lao等[4]以肝細胞癌Hep G2細胞系為研究對象，發現rhBMP-2可以在體內條件下促進肝細胞癌的生長及骨轉移過程，進一步證明分泌性磷蛋白24 kD(spp24)可以阻斷rhBMP-2對Hep G2細胞生長及骨轉移的作用，研究證明spp24有望成為肝細胞癌及肝細胞癌骨轉移的有效治療劑。本研究發現體外條件下rhBMP-2可顯著抑制肝細胞癌SK-Hep-1細胞的增殖能力。無血清條件下不同濃度的rhBMP-2處理細胞24小時，發現rhBMP-2可增加G1期細胞所占比率。rhBMP-2可顯著促進p21的表達，顯著抑制cyclin E的表達，并顯著抑制PI3K/Akt信號通路的磷酸化過程。研究證實在體外條件下rhBMP-2通過抑制PI3K/Akt信號通路的磷酸化過程對肝細胞癌SK-Hep-1細胞增殖能力發揮顯著抑制作用，

本項研究尚存在諸多不足之處：(1)研究中沒有設置spp24、noggin等對rhBMP-2及SK-Hep-1細胞系的影響，其相關性及作用機制尚需進一步探索。(2)本研究只是針對rhBMP-2對肝細胞癌SK-Hep-1細胞增殖能力的影響，而對細胞其它生物學行為的作用需進一步深入探討。

綜上所述，本研究通過上述實驗證實在體外條件下rhBMP-2對肝細胞癌SK-Hep-1細胞增殖能力具有顯著的抑制作用，并與PI3K/Akt信號通路密切相關。從基礎水平進一步論證了rhBMP-2的臨床應用不能顯著增加肝細胞癌的患病風險，為在脊柱融合手術及骨不連等骨科疾病的治療中應用rhBMP-2提供了一定的理論基礎。