早老素1基因circRNA在阿爾茨海默病中的表達

胡國艷，楊 欣，徐 鵬，許 瑩，林裕龍，羅新妮，鐘笑梅

(1.廣州醫科大學附屬第五醫院 a.檢驗科;b.藥學部，廣東 廣州510000；2.廣州市惠愛醫院(廣州醫科大學附屬腦科醫院)a.檢驗科;b.神經內科)

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是新近發現的一類共價鍵閉合環狀RNA分子。盡管早在1970年RNA病毒中就發現circRNA的存在[1,2]，但隨后的30年僅發現少數幾個環狀RNA，因其表達水平低被認為只是特定表達或RNA異常剪接的產物，并未受到重視，研究進展緩慢。隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，人們在真核細胞發現了大量circRNA[3]，且某些circRNA可以發揮競爭性內源RNA的作用來調控基因表達，還可以作為miRNA海綿來影響基因的調控和表達[4-6]。circRNA由于形成閉合的環狀，在生物體內非常的穩定[4,7]，因此，其有可能成為一種良好的生物標志物。

阿爾茨海默病(AD)是伴有常染色體缺陷和神經元喪失的神經退行性病變，發病機制尚不明確。目前認為γ-分泌酶是導致AD的關鍵因素之一[8]，γ-分泌酶是由四個膜整合蛋白組成的包含19次跨膜螺旋的復合體，包括PS1、Aph-1、Pen-2和Nicastrin四個亞基，主要參與β-淀粉樣蛋白前體(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過程，其中早老素基因PSEN1(Presenilin 1,PS1)是執行酶活性功能的膜整合蛋白酶活性亞基，為該酶的催化亞單位[9-12]。

前期研究表明circRNA大多是由外顯子參與環化[6]；我們推測PS1也有可能存在circRNA。對PS1基因的全長RNA 序列進行分析，PS1(基因登錄號NM_000021.3)mRNA 由12個外顯子組成；本研究針對12個外顯子分別設計反向PCR引物，來擴增可能存在的circRNA；通過這種方法，我們在人神經母細胞瘤SY5Y細胞系發現了由PS1 mRNA的第2、3、4、5外顯子環化而成的circRNA，此circRNA全長序列為615個核苷酸，我們將其命名為Cir-PS1-615。并建立了Cir-PS1-615的檢測方法，對AD患者與對照組血液進行了檢測。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑ABI7500 實時熒光PCR儀(Life公司)，PMD18-TA克隆載體(TAKARA公司)，TRIzol○RReagent(Life公司)，Nucleic Acid Stain 核酸染料(北京鼎國昌盛)，NormalRunTM250 bp-II DNA ladder(上海捷瑞)，全自動凝膠成像分析系統(上海培清)，HiScript○RII 1st Strand cDNA 合成試劑盒(Vazyme)，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix(Vazyme)。

1.2研究對象研究對象經1名神經科副高或以上醫師及1名精神科副高或以上醫師診斷一致方納入研究。AD組：從本院神經內科、老年精神科住院的AD患者收集共30例，其中男16例，女14例，年齡60-90歲。入組標準：(1)簡易精神狀態檢查(Mini Mental State Examination，MMSE)評分文盲≤ 17分，小學文化≤ 20分，初中及以上文化≤24分。(2)符合DSM-Ⅳ癡呆診斷標準。(3)符合美國神經病學、語言障礙和中風研究所及阿爾茨海默病與相關障礙協會(NINCDS-ADRDA)1984年修訂的“很可能AD”的診斷標準。(4)無甲狀腺功能低下、葉酸缺乏、維生素B12缺乏、物質濫用和感染等其它原因導致的癡呆病史。(5)頭顱MRI檢查排除血管性癡呆及腫瘤、腦積水等其它神經系統疾病導致的癡呆。正常對照(Normal Control，NC)組：從社區老人中招募，共30例，年齡50-74歲，其中男15例，女15例。入組標準：(1)無認知障礙主訴。(2)無神經或精神疾病史，無癡呆家族史。(3)MMSE評分文盲>17分，小學文化>20分，初中及以上文化>24分。(4)CDR=0分。(5)頭顱MRI檢查無明顯異常。入組者均簽署了知情同意書，并經本院倫理委員會批準。

1.3細胞培養SH-SY5Y(ATCC Number:CRL-2266)細胞于含10%胎牛血清(GIBCO)DMEM培養液中，置于5%CO2、37℃培養箱中培養。

1.4TA克隆和測序根據PS1基因的RNA(登錄號：NM_000021.3)序列設計12對反向PCR擴增引物，引物序列參見表1，提取SH-SY5Y細胞的總RNA ，然后用random 逆轉錄引物合成 cDNA，反向PCR擴增PS1的外顯子序列，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將PCR產物克隆到PMD18-TA克隆載體中，然后DNA測序鑒定。

表1 PCR引物序列

1.5RT-qPCR對入組患者抽取EDTA-K2抗凝血，按試劑說明書提取標本總RNA，反轉錄成cDNA，然后對樣本進行Cir-PS1-615檢測，同時檢測PS1mRNA，每個樣本重復檢測3次。內參為actin，引物序列及產物見表2。反應體系為10 μl ，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix 5 μl，Forward primer (10 μM) 0.2 μl，Reverse primer (10 μM) 0.2 μl，50x ROX Reference Dye 2 0.2 μl，模板DNA 2 μl，滅菌蒸餾水加至10 μl。反應條件為95℃ 5 min預變性；95℃ 10sec，60℃ 34sec，40個循環，每個循環結束時收集熒光；再加入熔解曲線：95℃ 15sec，60℃ 60sec，95℃ 15sec。根據2-△△C t公式計算目標基因相對表達情況。

表2 PS1 circRNA-615 and mRNA PCR檢測引物序列

2 結果

2.1TA克隆和測序結果分別針對PS1基因12個外顯子設計反向PCR擴增引物(圖1A)，擴增結果顯示PS1基因的 第2,3,4,5有明顯的擴增產物，擴增大小約600 bp(圖1B)；將PCR產物連接到TA克隆載體上進行DNA序列測定，比對分析后發現PS1基因的第2和第5外顯子首尾連接環化(圖1C、D)，PS1基因參與形成PS1-circRNA的長度為615 bp，將此circRNA命名為Cir-PS1-615 (圖1E)。

(A) Construction Chart of PS1 mRNA (Accession No.NM_000021),design of RT-PCR primers for each exon;(B) Agarose electrophoretogram for PCR products,significant amplification product is found in Electrophoresis Channel 2-5.M:Marker DL2000;(C) Results of TA cloning and sequencing for PCR product,with the arrow indicating connected sites for PS1 cyclization;(D,E) PS1 Exon 2-5 involved in the cyclization to generate circRNA-PS1,among which,Exon2:82 bp,Exon3:140 bp,Exon4:251 bp,Exon5:142 bp.circRNA-PS1 consists of 615 nucleotides.

2.2Cir-PS1-615在AD中的表達特異性檢測Cir-PS1-615，上游引物跨越環化位點，擴增大小176 bp(圖2A)；線性 PS1 mRNA的檢測引物擴增大小111 bp(圖2B)；通過對臨床AD患者的血液標本進行PT-QPCR基因表達檢測，結果顯示Cir-PS1-615 在AD患者中表達量普遍下降(n=30，P<0.05)(圖2C)；線性的 PS1 mRNA 在AD 患者中表達量升高(圖2D)；Cir-PS1-615和線性的 RNA 比例成負相關。

(A) PCR primer testing PS1 circular RNA,spanning cyclization binding sites,amplified size of 176 bp；(B) PCR primers testing PS1 linear RNA,spanning exons 8 and 9,amplified size of 111 bp；(C,D) RT-QPCR detection of expression differences between PS1 circular RNA and linear RNA in the AD patients and control groups.

3 討論

我們的結果顯示人PS1基因客觀存在一種環狀RNA，且在AD患者中Cir-PS1-615表達明顯降低，和線性的PS1 mRNA表達呈現負相關。本研究樣本量有限，還需要進行大樣本的驗證。在本文發出時，我們查閱到circBase里已經有了PS1環狀RNA的資料，也有一個615 bp的環狀RNA，經比對，正是我們檢測到的Cir-PS1-615。

目前對于circRNA的具體功能尚未明確，只有幾種假定的說法：1) circRNA可以作為“sponge”海綿吸附miRNA ，抑制其功能[13]；2) circRNA通過堿基互補配對直接調控其他RNA水平[5]；3) circRNA能與蛋白質結合,抑制蛋白質活性、募集蛋白質復合體的組分或調控蛋白質的活性[14]；4) circRNA也可作為翻譯的模板指導蛋白質的合成[15,16]。對于PS1 蛋白的生物學功能研究比較多，有大量文章報道PS1基因的突變與AD密切關聯[17-19]，PS1作為 γ-分泌酶的重要組分參與APP的代謝途徑，還參與Notch通路和Wnt信號通路等[20-23]，那么Cir-PS1-615是否和AD疾病有關聯？ Cir-PS1-615在AD疾病和對照中有表達性差異，我們推測Cir-PS1-615在AD疾病發生發展過程中有重要的生物學功能。Cir-PS1-615發揮生物學功能是通過哪一種方式？為什么其表達量和線性的PS1 mRNA 呈現負相關？這是我們以后要解決的問題。目前對于Cir-PS1-615產生環化的具體機制還不清楚，最近有研究報道RNA結合蛋白QKI能特異性結合基因的內含子中，促進circRNA的產生，在EMT過程中circRNA可能扮演重要角色[24]；雖然通過高通量測序結合生物信息學分析提示在生物體內客觀存在大量circRNA，但是大部分circRNA的功能還是未知。人們開展circRNA的生物學功能及其在人類疾病發生、發展中作用的研究才剛剛起步，因此對于circRNA有待我們更多的探索。

本課題組研究發現了AD密切關聯基因PS1的一種RNA環化現象，此circRNA的發現為進一步明確PS1基因的生理學功能打下基礎。circRNA由于其形成封閉的環狀，在細胞內外可以很穩定的存在，且可以在血液循環中流動，我們通過臨床AD患者的血液標本PT-QPCR檢測發現，Cir-PS1-615 在AD中表達明顯降低，因此Cir-PS1-615有可能成為更加理想的檢測阿爾茨海默的早期臨床診斷指標。對Cir-PS1-615生理學功能的研究，可以為以后開發預防治療阿爾茨海默的靶點藥物打下基礎。