Nrf2信號通路在阿特拉津誘導小鼠肝臟氧化損傷中的作用

張佳悅,陳俊宇,趙本正,吳 珊,劉 劍*,孫連平*

(1.延邊大學醫學院，吉林 延吉133000；2.吉林大學第二醫院，吉林 長春130041)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，atrazine，ATR)是全球范圍廣泛使用的廣譜除草劑之一，目前，殺蟲劑和除草劑已成為農業系統中不可分割的一部分。據美國環保局數據統計，在北美的一些河流中，ATR的濃度高達108 μg/L。在中國，太湖和遼東河水中的ATR濃度也遠遠超過了3 μg/L的飲用水標準，在遼東河，ATR的濃度甚至達到18.93 μg/L[1,2]。在接觸ATR的農民的血液和尿液中己經檢測到了ATR污染[3]。

在墨西哥哈利斯科州Nextipac社區發現接觸ATR的工人存在器官和細胞水平的異常[4]。美國肯塔基州公共飲用水中的ATR也增加了當地孕婦早產比率[5]。大量的研究發現，ATR具有神經系統、免疫系統、內分泌系統、生殖系統等多系統毒性、氧化應激損傷及腫瘤促發作用[6]，ATR的危害已經引起學者們廣泛的重視。

大量報道中提到ATR可以誘導脂質過氧化反應[7-9]。活性氧生產增多可以導致DNA單或雙鏈的斷裂[10]，最近，在各種動物體內進行了關于ATR誘導的氧化損傷的研究，如小鼠、蚯蚓、魚等[10-14]。Singh[12]等人研究表明，在雄性Wistar小鼠體內ATR可以誘導氧化應激，增強脂質過氧化和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)的活性。Jin等人[13]研究了成年雌性斑馬魚接觸ATR后在過氧化壓力下的反應，結果顯示在肝臟中，SOD和CAT活性增高。Bhatti JS等[15]證實了ATR在小鼠紅細胞中提高丙二醛(MDA)水平，提高CAT、SOD、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。

本實驗通過給小鼠不同劑量的ATR連續灌胃，觀察小鼠肝臟組織的活性氧水平和Nrf2/ARE信號通路相關蛋白的含量，其目的是確定ATR對小鼠肝臟的氧化損傷，分析肝臟在氧化損傷下的保護機制。

1 資料與方法

1.1動物分組及處理

4周齡雌性C57B l/6小鼠購于吉林大學基礎醫學院實驗動物中心，32只隨機分4組。以等體積玉米油為對照，阿特拉津分別選擇5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR[16]。小鼠以恒定溫度、恒定濕度飼養于該中心，小鼠連續28天每日上午灌胃，第29天麻醉下腹主動脈取血處死，取新鮮肝臟組織。

1.2主要試劑及儀器

阿特拉津為美國Sigma Aldrich產品，純度99%，玉米油溶解。CAT檢測試劑盒為南京建成公司產品。兔抗Nrf2、Keap1、NQO1、HO1單克隆抗體為Proteintech Group公司(美國)產品。羊抗兔IgG(二抗)和ECL試劑盒購自美國promega公司。其余試劑為美國Sigma公司產品。凝膠成像系統(2500R)為中國Tanon生產，電泳儀(AE-8800)為美國Bio-rad生產，分光光度計(VIS-7220)為北京第二光學儀器廠產品。

1.3檢測CAT、GSH活力和NO、MDA含量

冰上研磨制備10%肝臟組織勻漿，測定蛋白濃度(bradford法)，-20℃保存備用。依照試劑盒說明書檢測肝臟組織的CAT、GSH活性及NO、MDA含量。

1.4Westernblot方法檢測Nrf2、NQO1、Keap1、HO1蛋白表達

加入液氮的同時研磨肝臟組織，冰浴條件下裂解蛋白，離心取上清，定量后取30 μg，加入緩沖液，99℃水浴，恒壓SDS-PAGE電泳(75 V 30 min，120 V 60 min)，轉膜(100 V，1 h)，牛奶封閉，TBST洗膜，封閉一抗、二抗，ECL發光顯色。GIS 凝膠成像分析系統分析光密度值，分別計算Nrf2、NQO1、Keap1、HO1的相對光密度(A)值(內參β-actin)。

1.5統計學分析

2 結果

2.1NO、MDA含量增高

本實驗以生化檢測分析ATR作用下肝臟組織勻漿的活性氧水平，結果如表1顯示：濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR提高肝臟組織勻漿中NO含量，濃度125 mg/kg的ATR提高MDA含量(與對照組相比，P<0.05)，提示ATR誘導小鼠肝臟組織活性氧水平增高。

表1 肝臟組織內MDA及NO含量

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表達變化

本實驗進一步通過western blot法分析小鼠肝臟組織中Nrf2和Keap1的蛋白含量，分析了ATR持續作用下小鼠肝臟中Nrf2的激活情況。結果如圖1，中、高ATR劑量組(25 mg/kg和125 mg/kg)相對于0 mg/kg劑量組，Nrf2的表達明顯增高(P<0.01)，Keap1的蛋白含量逐漸降低，甚至低于對照組(P<0.05)。

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05；**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表達增高

為了進一步分析Nrf2通路激活后肝臟組織中Ⅱ相解毒酶的變化，本實驗通過Western blot法檢測HO1和NQO1的含量。結果顯示：相對于對照組，濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR促使HO1和NQO1的表達上調(P<0.01)，見圖2。

**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

2.4CAT和GSH的活力變化

為了分析Nrf2通路激活后肝臟中抗氧化酶的變化，本實驗檢測CAT和GSH的活力。結果顯示：與5 mg/kg組相比，濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力減弱(P<0.05)；濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力減弱(P<0.05)，見表2。

3 討論

ATR及其代謝產物于地表水、地下水中經常可以檢測到[17]，在家中同樣可以檢測到ATR，并且可以追蹤到泥土[18]。在ATR暴露人群的尿液中已經檢測出ATR的代謝物[19]。考慮到ATR的生物蓄積作用，ATR的損害應引起足夠的重視。最近，在各種動物體內進行了關于ATR誘導的氧化損傷的研究，如小鼠、蚯蚓、魚等[10-14]。本實驗通過給小鼠連續灌胃28天，以等體積的玉米油為對照，實驗組給以濃度為5 mg/kg、25 mg/kg以及125 mg/kg的ATR，第29天腹主動脈取血處死小鼠，觀察小鼠肝臟組織的活性氧水平和Nrf2/ARE信號通路相關蛋白的含量。

表2 肝臟組織內CAT的活力

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05；**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

當自由基生成和來自防御系統的降解失衡時會導致自由基的積累，活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)過高就是自由基積累的典型[20]。當ROS產生過多時可以與各種分子如脂類、碳水化合物、蛋白質和DNA反應，從而改變了它們的結構和功能，產生細胞損傷，導致病理過程，包括動脈粥樣硬化、癌癥、關節炎等潛在的有害反應[1]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)是脂質過氧化反應中過氧自由基(ROO·)重排環化后形成的過氧化作用的最終產物[15]。為印證ATR對小鼠肝臟的氧化損傷，本實驗分析了ATR作用下肝臟組織勻漿的活性氧水平，發現：與對照組相比，ATR上調MDA和NO水平，說明ATR誘導肝臟組織勻漿的活性氧水平提高。

在氧化應激狀態下，至關重要的信號通路如Kelch-like ECH-associated protein (Keap1)/NF-E2-related factor 2 (Nrf2)信號通路是針對氧化損傷產生的早期保護性機制[15]。生理狀態下，Nrf2與Keap1結合，將Nrf2固定于胞漿，Nrf2活性被抑制[21]，修改重塑Keap1的半胱氨酸殘基，如氧化和S-亞硝基化，導致Nrf2易位到細胞核[6]后，刺激編碼解毒酶和抗氧化酶的基因轉錄，以消除活性氧，保護細胞[22]。

因此在發現ATR作用后肝臟組織活性氧水平增高后，我們進一步分析Keap1/Nrf2信號通路的表達情況，發現ATR處理后Nrf2的表達增高，Keap1的蛋白含量低于對照組。分析原因可能是由于ATR誘導肝臟組織中氧自由基生成過多，促使肝臟組織在ATR的氧化壓力下發生適應性反應，刺激Nrf2表達上調，Keap1的表達下調，使更多的Nrf2解離進入細胞核，進一步激活Nrf2信號通路。

Nrf2進行信號轉導，與抗氧化反應元件(antioxidative reactive element，ARE)結合[15]，啟動ARE下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄[15]。血紅素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1)和苯醌氧化還原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl)是主要的抗氧化酶之一，用于清除過氧化氫[22]。

本實驗中，在ATR的作用下，HO1和NQO1蛋白含量上調。較高劑量的ATR將會超出肝臟組織的抗氧化系統的容忍力，機體抵抗氧化損傷的能力與抗氧化酶的水平和類型相關[23]。本實驗中，濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力減弱，濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力減弱。在一般情況下，活性氧生成增加時，CAT和GSH含量增高，將過氧化氫分解為水和氧分子[23]，分析可能是ATR所引起的H2O2產生增多，使CAT和GSH消耗高于其他抗氧化酶。相對較高的ATR接觸劑量下，ATR誘導的氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力[24]，當然，在相對較高劑量的ATR作用下，肝臟的Ⅱ相解毒酶HO1和NQO1蛋白含量仍是增高的，說明此時肝臟主要依靠Ⅱ相解毒酶的作用抵抗氧化損傷。

綜上，ATR可以誘導小鼠肝臟氧化應激作用，肝臟組織反應性提高了Nrf2的表達，通過Keap1/Nrf2/ARE通路上調Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達。在ATR中劑量組和高劑量組，ATR誘導的氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力，CAT活力減弱，印證了ATR對肝臟的氧化損傷作用。本實驗通過分析ATR作用下肝臟活性氧水平和Nrf2信號傳導通路的表達情況，探討了ATR暴露對肝臟的氧化損傷，有助于進一步探索ATR對肝臟的損傷機制。

4 結論

ATR可以誘導小鼠肝臟氧自由基生成增多，肝臟組織激活Nrf2信號通路，上調Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達。當ATR濃度增高，氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力，CAT和GSH活力減弱，印證了ATR對肝臟的氧化損傷作用。