AEG-1肺歸巢域與Flagellin融合基因的桿狀病毒制備及鑒定

王 希，王 琳，張 喆，龍 敏，董 軻，張惠中

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院 臨床實驗與檢驗科,陜西 西安710038)

近年來，以腫瘤特異靶抗原為基礎(chǔ)的病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)疫苗研發(fā)越來越受重視[1-3]，此類疫苗因攜帶病毒抗原成分，可模擬病毒抗原呈遞過程，故可以高效激發(fā)機體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，活化CD4+及CD8+細胞，突破腫瘤微環(huán)境中免疫耐受，發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。

星形細胞上調(diào)基因-1(Astrocyte elevated gene-1，AEG-1)[1]與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤組織中均高表達[5,6],而在正常組織中表達非常低、甚至不表達，因此作為一種新的腫瘤免疫治療候選靶點備受矚目。Rown和Ruoslahti[7]發(fā)現(xiàn)，AEG-1蛋白C端的肺歸巢蛋白結(jié)構(gòu)域(Lung Homing Domain，LHD)能夠介導腫瘤細胞粘附到遠處器官的血管并促進腫瘤轉(zhuǎn)移，具有多種重要細胞生物學功能。因此，以AEG-1的C末端肽段制備腫瘤疫苗理論上可在體液和細胞免疫雙重作用下發(fā)揮抑瘤作用。

本研究擬采用重疊PCR的方法構(gòu)建AEG1 LHD區(qū)與flagellin(C)蛋白的融合基因，在其N端和C端分別添加SIV gag env gp41的信號肽(SP)與跨膜區(qū)(TM)構(gòu)建融合表達蛋白AEG-1C-Flic，并通過桿狀病毒表達系統(tǒng)制備其桿狀病毒，以期通過逆轉(zhuǎn)錄病毒gag產(chǎn)生VLPs 的特點，增加AEG-1C-Flic VLPs的組裝效率，為后期獲得高產(chǎn)量的AEG-1C-Flic VLPs奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及細胞株 質(zhì)粒： 含有SIV env 的質(zhì)粒pCAGGS/gp41由美國EMORY大學ChingLai Yang教授饋贈；含有AEG-1全長基因的克隆載體AEG1-TV、真核表達載體pCAGGs及桿狀病毒表達載體pFastbacTM、昆蟲細胞Tn5、鼠傷寒沙門菌、E.coliJM109、E.coliDH5a和E.coliDH10bac均由本室保存。

1.1.2主要試劑、儀器 昆蟲細胞培養(yǎng)液SF-900Ⅱ、轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ、Grace’s Insect Medium、Lipofectamine2000購自Thermo Fisher Scientific公司，分子克隆載體及相關(guān)輔助試劑，Prime STAR HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI及XhoI及抗菌藥物均購自于寶生物工程有限公司(大連Takara公司)，QSM-O3SP/50蛋白質(zhì)濃縮儀購自美國通用公司，Hitachi-H7500透射電鏡由唐都醫(yī)院疼痛生物研究所提供。

1.2方法

1.2.1鼠傷寒沙門桿菌Flagellin(C) PCR引物合成 根據(jù) Genbank(D13689.1)中發(fā)布的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白的基因序列，設(shè)計Flagellin (C)PCR引物。引物序列為：F1：5’-CCC GGATCC ATG GGCACAAGTCATTAATACAA-3’ (引入BamH1酶切位點);F2：5’-CCC GAATTC TTAACGCAGTAAAGAGAGGACGTTTT-3’ (引入EcoRI酶切位點)。引物由北京奧科鼎盛生物科技公司合成。

1.2.2目的基因的PCR擴增 利用OMEGA公司的細菌基因組提取試劑盒從新鮮的沙門氏菌菌液中提取沙門氏菌基因組，菌體DNA提取純化后進行 PCR擴增Flagellin (C)基因片段，程序為：94℃ 5 min；94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR反應(yīng)完成后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶。

1.2.3重組質(zhì)粒pMD18-T-FliC的構(gòu)建 回收目的片段后，回收產(chǎn)物與克隆載體PMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli JM109，于Amp+的LB培養(yǎng)板上37℃過夜培養(yǎng)。隨機挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定。對酶切鑒定正確的重組載體測序，測序正確的重組DNA載體命名為Tv/FliC。

1.2.4AEG1-LHD-flagellin融合基因引物設(shè)計 含有信號肽與跨膜區(qū)的AEG1-LHD-flagellin融合基因采用重疊PCR的方法制備，根據(jù)Genebank中AEG1與flagellin序列，設(shè)計重疊PCR引物如下：P1: 5’-CCC GAATTCAT GCGCGTGAAAGGCATTCG-3’(引入EcoRI酶切位點)；P2: 5’-AACCTGAAGTGTGGCGGAGCAAAT-3’；P3: 5’-ATTTGCTCCGCCACACTTCAGGTT-3’；P4:5’-TTAATGAC-TTGTGCAGCTATTTCTT-3’;P5: 5’-AAGAAAGAGCTGCACAAGTCATTAA-3’;P6: 5’-AATCATGATGAAACGCAGTAAAGAGAG-3’;P7:5’-CT CTCTTTACTGCGCTCTTTACTGCGTT-TCATCATGATT-3’;P8: 5’-CCC CTCGAG TTACAGCAGGGCGCGCTCGAAG-3’ (引入XhoI酶切位點)。

1.2.5含有信號肽與跨膜區(qū)的AEG1-LHD-flagellin融合基因擴增 P1、P2為引物，質(zhì)粒pCAGGS/gp41為模板，擴增獲得片段A； 以質(zhì)粒AEG1-TV為模板，P3、P4為引物PCR擴增獲得片段B；再以A、B為共同模板，P1、P4為引物PCR擴增獲得片段C； Flagellin-TV質(zhì)粒為模板，P5、P6為引物擴增獲得D；再以C、D為共同模板，P1、P6為引物PCR擴增獲得產(chǎn)物E；以質(zhì)粒pCAGGS/gp41為模板，P7、P8為引物，PCR擴增獲得產(chǎn)物片段F；以E、F為共同模板，P1、P8為引物PCR擴增，最終獲得含有信號肽與跨膜區(qū)的AEG1-LHD-flagellin融合基因，命名為AEG-1C-Flic。

1.2.6重組AEG-1C- Flic桿狀病毒pFastbacTM表達載體的構(gòu)建 回收并純化經(jīng)EcoRI/Xho I雙酶切的PCR片段AEG-1C- Flic及pFastbacTM載體，T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli DH5α，涂布LB/Amp +培養(yǎng)板。隨機挑取單克隆菌落過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA， EcoRI/Xho I雙酶切鑒定并測序， 得到含gp41信號肽和跨膜區(qū)的AEG-1C- Flic融合基因的pFastbacTM載體，命名為pF/AEG-1C- Flic。

1.2.7重組質(zhì)粒pF/AEG-1C- Flic轉(zhuǎn)座 1 μl pF/AEG-1C- Flic加入到100 μl E.coli DH10Bac感受態(tài)細胞中，冰浴30 min后42℃熱激45 s，加入900 μl LB 培養(yǎng)基，37℃ 220 rpm/min培養(yǎng)4 h，菌液稀釋后涂布于含50 g/ml卡那霉素、7 g/ml慶大霉、10 g/ml四環(huán)素、100 g/ml X-gal、40 g/ml IPTG的篩選培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)，直至白色菌落清晰可見。

1.2.8AEG-1C- Flic Bacmid鑒定 隨機挑取陽性白色單克隆菌落，同時挑取藍色克隆作為陰性對照，過夜培養(yǎng)后按照PureLinkTM Hipure Plasmid Miniprep Kit說明書提取桿粒DNA(Bacmid)，PCR鑒定。鑒定引物按照說明書合成，序列為F：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’；R：5’-AGCGGATAATTTCACACAGG-3’。 反應(yīng)程序：94℃、5 min；94℃、45 s，55℃、45 s，72℃、5 min，30cycles；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.9重組桿粒轉(zhuǎn)染細胞 6孔板中接種5×105個Tn5細胞，待細胞貼壁后混合10 μl轉(zhuǎn)染試劑與1μg Bacmid，按照CellfectinII Reagent說明書轉(zhuǎn)染(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后6h，換成Sf-900II SFM培養(yǎng)基。待細胞出現(xiàn)病變后收集細胞培養(yǎng)上清，命名為AEG-1C- Flic rBv P1。

1.2.10AEG-1C- Flic rBv的擴增及鑒定 將上述收集的P1代病毒上清8 000 rpm/min，4℃離心30 min，取病毒上清液，感染Tn5細胞，2-3 d后，至90%以上轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，收集細胞懸液4℃、8 000 rpm離心20 min，取上清，培養(yǎng)液中含有第2代病毒，命名為P2；FastplaxTM病毒滴度測定試劑盒測定病毒滴度。并用Western Blot檢測AEG-1C-Flic rBv P2。一抗、二抗分別為為AEG-1單克隆抗體(Sino Biological公司)和山羊抗小鼠IgG。

2 結(jié)果

2.1細菌鞭毛蛋白Flagellin基因的克隆及鑒定

從鼠傷寒沙門桿菌基因組DNA中常規(guī)PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見1條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期值相符，約為1 488 bp。克隆入T載體，提取重組質(zhì)粒并進行BamHI/XhoI雙酶切，1%瓊脂糖電泳后出現(xiàn)2條帶，分別與pMD-18T載體和fliC基因片段大小相符(圖2)，DNA測序結(jié)果經(jīng)比對后確定其開放讀碼框架正確，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2AEG1-C-FliC目的片段的擴增及其桿狀病毒表達載體的構(gòu)建及鑒定

AEG1-C-FliC融合基因模式圖如圖3所示，經(jīng)重疊PCR獲得2 517 bp的AEG-1C-FliC目的片段(圖4)，克隆入pFastBacTM載體，經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切鑒定，大小正確(圖5)，測序結(jié)果與AEG1肺歸巢域及FliC基因序列完全一致，且含有g(shù)p41的信號肽及跨膜區(qū)。

圖1 Flagellin (C)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2 重組質(zhì)粒 pMD18-T-Flagellin(C) 的雙酶切鑒定

圖3AEG-1C-FliC融合基因結(jié)構(gòu)示意圖

2.3AEG-1C-FlicBacmid制備及鑒定

Pf/AEG-1C- Flic質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli DH10Bac，經(jīng)藍白篩選獲得白色陽性克隆。挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)并提取Bacmid，鑒定結(jié)果顯示PCR獲得約4 817 bp大小的片段(2 300 bp載體片段+2 517 bp目的基因片段)，與預(yù)期相符(圖6)，同時設(shè)有陰性對照與陽性對照(本室構(gòu)建)，PCR結(jié)果顯示陰性對照條帶為300 bp大小片段。

圖4 AEG-1C-FliC融合基因 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖5 重組質(zhì)粒 PF/AEG-1C-FliC的雙酶切鑒定

1.DL5000 Marker 2.陽性克隆Bacmid #1 3.陽性克隆Bacmid #2 4.陰性克隆 5.本室陽性對照Bacmid

圖6重組BacmidPCR鑒定

2.4AEG1-C-Flic桿狀病毒制備及鑒定

AEG-1C- Flic Bacmid轉(zhuǎn)染Tn5細胞5天后顯微鏡下觀察，圖7顯示與陰性對照細胞相比，轉(zhuǎn)染后的Tn5胞漿內(nèi)出現(xiàn)絲狀或顆粒樣物質(zhì)，細胞腫脹，折光性增強，收集細胞培養(yǎng)液即為P1代病毒。P1代病毒擴增后獲得P2代病毒，F(xiàn)astplaxTM病毒滴度測定試劑盒測定病毒滴度達到 5×(107-108) pfu/ml之間。取P2代病毒上清進行Western Blot檢測，結(jié)果顯示(圖8)在90 kDa處有目的條帶，預(yù)期目的條帶大小一致。

圖7 Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細胞后 5天

1.蛋白Marker 2.AEG-1C-Flic rBv 感染Tn5細胞后培養(yǎng)上清 3.未感染細胞培養(yǎng)上清

圖8WesternBlot方法檢測P2代病毒上清結(jié)果

3 討論

隨著人們對腫瘤免疫機制的進一步認識，以腫瘤特異靶抗原為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗研發(fā)越來越受重視。單跨膜蛋白AEG-1與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此AEG-1作為腫瘤疫苗抗原具有特異性高，廣譜性好等優(yōu)點，有望成為一種應(yīng)用前景非常好的新腫瘤免疫治療候選靶點。相關(guān)研究制備AEG-1核酸疫苗[8,9]，小鼠體內(nèi)試驗證實該疫苗可顯著刺激機體產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細胞生長，說明AEG-1作為腫瘤疫苗靶點具有可行性，但DNA疫苗在患者中具有較低的接受程度，探索免疫原性強的AEG-1疫苗制備新策略仍具有較大意義。

病毒樣顆粒(VLPs)是利用病毒的結(jié)構(gòu)蛋白可在細胞內(nèi)自行裝配成一個不含核酸成份的病毒粒子的特性開發(fā)而成的一種新型疫苗研發(fā)技術(shù)平臺。目前常用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白有HBVs，HPV[10]，SIV gag蛋白，HIV gag蛋白，Ebola病毒VP40蛋白[11]等。gag基因編碼的蛋白可被蛋白水解酶裂解成能夠自我裝配成核心顆粒的基質(zhì)(MA)、衣殼(CA)及核衣殼(NC)[12]三個結(jié)構(gòu)蛋白，此3個結(jié)構(gòu)蛋白以出芽方式分泌到胞外時可獲得包膜及膜蛋白。

近年來，抗腫瘤VLPs疫苗的研發(fā)突飛猛進并取得了巨大成功。隨著人們對腫瘤免疫認識的進一步深入，以腫瘤特異靶抗原為基礎(chǔ)的治療性VLPs疫苗研發(fā)越來越受到人們重視，已有多種腫瘤特異性靶抗原用于VLPs疫苗研究，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。腫瘤特異性抗原VLP的制備策略中合理選擇病毒結(jié)構(gòu)蛋白為首要問題。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)蛋白gag可在真核細胞中自行裝配成病毒樣顆粒，在VLPs組裝過程中g(shù)ag蛋白的三種結(jié)構(gòu)域各自發(fā)揮不同功能，以出芽形式形成VLPs過程中獲得包膜及膜蛋白。研究表明，可以利用gag的此特性將外源性的跨膜蛋白錨定在gag的包膜上獲得VLPs。

在疫苗的研發(fā)過程中，通過添加免疫佐劑的方式增加免疫原性已被廣泛應(yīng)用。細菌鞭毛由基礎(chǔ)小體、鉤狀體和絲狀體三個部分組成，鞭毛蛋白(Flagellin)是細菌鞭毛絲狀體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以被Toll樣受體-5(TLR5)識別并激發(fā)機體固有免疫應(yīng)答，通過活化NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路，包括IL-1β、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子及各種適應(yīng)性免疫應(yīng)答效應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄活化，促進機體免疫應(yīng)答的激活[13-15]，且使用較低劑量(1-10 μg)的Flagellin即可誘導機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答效果[16,17]。研究表明，引入Flagellin作為流感病毒疫苗的免疫佐劑制備嵌合型病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)疫苗可增強機體免疫應(yīng)答[18]，其作為腫瘤疫苗佐劑雖有報道[19,20]，但用于腫瘤特異性抗原VLPs疫苗的研究目前未見報道。

本研究首先從鼠傷寒沙門桿菌基因組DNA中擴增出鞭毛蛋白Flagellin并構(gòu)建其克隆載體，結(jié)合AEG-1肺歸巢域的特點，以及gag蛋白組裝形成完整的病毒樣顆粒的優(yōu)勢，利用重疊PCR的方法構(gòu)建帶有SIV env gp41的信號肽區(qū)域和跨膜區(qū)的AEG-1 C端與Flagellin的融合基因，成功構(gòu)建了AEG-1 C-Flic融合表達載體。利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng),將構(gòu)建的AEG-1C-Flic重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過轉(zhuǎn)座獲得重組桿粒Bacmid，將其轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾細胞后，產(chǎn)生重組桿狀病毒。在后續(xù)實驗中，我們擬將AEG-1C-Flic rBv與SIV gag rBv共感染制備VLPs，并進一步通過動物實驗評價該疫苗激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫應(yīng)答水平，分析其抑瘤作用， 期望最終研發(fā)出組裝效率高、免疫原性強的AEG-1C-Flic 嵌合VLPs 疫苗，并為其它腫瘤抗原疫苗的設(shè)計提供一個全新思路和方法。

致謝感謝第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院臨床實驗與檢驗科實驗室的老師和同事在課題開展中給予的技術(shù)指導和支持。