柯薩奇病毒B組IgM抗體檢測抗原片的研制,優化及應用價值的研究

常 靜，張曉剛，金玉芬，吳麗霞，于 庭*

(1.吉林大學第二醫院,吉林 長春130041;2.北京英諾特生物技術有限公司；3.沈陽醫學院附屬第二醫院)

柯薩奇病毒B組(CoxB)是單股正鏈小RNA病毒，是呼吸道感染的主要病原體之一。根據血清型，該B組病毒可分為B1、B2、B3、B4、B5、B6六種類型，主要侵犯免疫力底下的圍生兒，可引起腦膜炎，中樞神經系統感染等多種疾病，亦是引起病毒性心肌炎的主要病原體之一，占病毒性心肌炎誘因的20%-25%，病情嚴重者可導致死亡。CoxB傳染源為病人及隱性感染者，可經口、呼吸道、腸道傳播或胎兒宮內傳染。多流行于夏、秋季節，一般呈散發或地區性暴發流行[1,2]。目前常規檢測手段是病毒分離、血清抗體檢測、核酸檢測，而間接免疫熒光法被認為是除病毒分離法以外的金標準。有研究表明，在CoxB感染的早期，人體內產生的IgM抗體可持續存在數周。故此特異性抗體的出現可以作為CoxB的急性期或持續期感染診斷的重要指標之一[3]。抗原片的研制對應用間接免疫熒光法檢測CoxB-IgM的特異性和靈敏性尤為重要，為了臨床能夠更加方便，高效的診斷CoxB感染，本文運用細胞培養技術，制備并優化CoxB抗原片，結合間接免疫熒光法對臨床樣本的CoxB-IgM抗體進行檢測，并對其性能和應用價值進行評價。

1 材料與方法

1.1菌種

來源于北華大學生命科學研究中心提供的柯薩奇病毒B組分離株。

1.2細胞

北京協和醫院提供的人源Hep-2細胞。

1.3血清

(1)沈陽醫學院附屬第二醫院2016年9月-2017年7月收治的CoxB感染患者的血清。其中陽性血清43例，陰性血清555例。

(2)VIRION(U.S.),INC.(簡稱“VIRION”)的柯薩奇病毒IgG試劑盒(ELISA法)，在間隔2周后檢測的IgG抗體水平呈4倍升高的血清樣本，確認為急性感染樣本，共30例。

(3)應用北京貝爾生物工程有限公司(簡稱“北京貝爾”)的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)，按照試劑盒說明書，檢測30例急性感染樣本，選擇應用于本試驗的內控陽性血清1、2。陽性血清1：S/CO值為5.5，陽性血清2：S/CO值為1.2。再用該試劑盒檢測健康人的血清，選擇應用于本試驗的內控陰性血清1、2。陰性血清1：S/CO值為0.08，陰性血清2：S/CO值為0.04。

(4)交叉反應血清：30份肺炎支原體(MP)陽性血清(CoxB陰性)，30份肺炎衣原體(CP)陽性血清(CoxB陰性)，均來自于沈陽醫學院附屬第二醫院。

1.4儀器與試劑

Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒。北京貝爾的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)。VIRION的柯薩奇病毒IgG試劑盒(ELISA法)。

1.5抗原片的制備

1.5.1毒株鑒定 取病毒培養的Hep-2細胞上清210 μl于1.5 ml無菌管中，按照Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒說明書提取基因組，并加入1 μl(40U)RNA酶抑制劑RNasin，混勻后于-70℃保存備用。作為PCR擴增反應的模板。

在NCBI上搜索該病毒序列，根據Sequence ID:gbAF160095.1序列選擇保守區(301-480)設計兩條引物：(F：ACAGAACCAGTTAAGGATG；R：TAAGGTAGTCGGGCCACACACC)進行PCR擴增。選用上游引物F，在全自動測序儀上進行單向測序，得到的結果與基因庫比對，鑒定毒株。

1.5.2抗原片的制備 將經鑒定的毒株用含有2%胎牛血清的DMEM(細胞維持液)將病毒稀釋到10-3。在生長良好的Hep-2單層細胞培養物內接種適量CoxB[4]。當細胞病變達一定程度時，用0.25%的胰酶消化細胞，制備成細胞懸液后,滴加1 ml在蓋玻片上，37℃ CO2培養箱中培養后，用0.01M PBS浸洗一次，晾干，用無水乙醇-20℃過夜固定。風干后即為制備好的CoxB抗原片。

1.6抗原片制備條件的優化

1.6.1感染細胞病變程度的選擇 CoxB接種到Hep-2細胞單層后，觀察細胞病變的程度，分別選擇細胞病變15%、25%、35%時，用0.25%的胰酶消化細胞，制成細胞懸液，分別滴到蓋玻片上，每張蓋玻片滴加1 ml，制成抗原片，并與吸附劑，稀釋液及熒光素標記的二抗組成檢測試劑，利用在不同細胞病變程度下研制的試劑分別對陽性血清1、2，陰性血清1、2進行檢測。

1.6.2CoxB細胞含量的選擇 當細胞病變達一定程度時，用0.25%的胰酶消化細胞制成細胞懸液，分別取濃度為105、106、107/ml的細胞懸液1 ml制備抗原片，利用抗原片制備成檢測試劑，并分別對陽性血清1、2，陰性血清1、2進行檢測[5,6]。

1.7間接免疫熒光法(IFA)檢測

選擇上述抗原片制備的最佳條件制備抗原片，與吸附劑，稀釋液及熒光素標記的二抗組成檢測試劑，對收集的樣本進行檢測。

將25 μl血清與等體積吸附劑混合后，1 000 rpm離心10 min。取吸附后血清樣本40 μl加入到160 μl樣本稀釋液中，混勻，取15 μl血清進行檢測。第二抗體使用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人IgM抗體，樣本在經過熒光染色后，置于熒光顯微鏡下觀察。陽性結果顯示CoxB細胞的細胞核、胞漿或胞膜出現綠色熒光，陰性結果顯示CoxB的細胞呈紅色。

1.8臨床樣本的檢測

1.8.1對比試驗 利用研制的試劑，與北京貝爾的柯薩奇B組病毒IgM抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)同時對收集的598例血清進行檢測，操作嚴格按照試劑盒使用說明書執行。將兩種方法檢測的結果進行比對，用SPSS17.0軟件對試驗結果進行統計學分析。

1.8.2急性感染試驗 利用研制的試劑對30例急性感染樣本進行檢測。

1.8.3交叉反應試驗 利用研制的試劑對30份MP-IgM陽性血清，30份CP-IgM陽性血清進行檢測。

2 結果

2.1毒株鑒定結果

圖1是以上游引物F：ACAGAACCAGTTAAGGATG為測序引物，進行單向測序后，用NCBI-Blast進行比對的結果。因單向擴增自身的特點，擴增之初的序列不穩定，故選取稍后位置堿基序列進行比對，結果顯示score為219 hits，identities值為118/118(100%)，gaps為0/118(0%),表明該毒株為柯薩奇病毒B組。

圖1 單項擴增序列比對結果

2.2抗原片制備條件的優化結果

2.2.1細胞病變的選擇結果 結果顯示當細胞感染25%時消化細胞滴制備的檢測試劑，內控血清的陽性和陰性結果的較好。見表1。

表1 CoxB感染細胞病變程度的選擇

注：++：陽性；+：弱陽性；-:陰性。

2.2.2CoxB細胞含量的選擇結果 見表2。試驗中選擇了3個細胞濃度105/ml、106/ml、107/ml，結果顯示在一個蓋玻片上滴加病變細胞1 ml時，病變細胞濃度為106/ml密度的檢測結果較好(圖2)。

表2 CoxB抗原片細胞含量的選擇

注：++：陽性；+：弱陽性；-:陰性。

圖2 CoxB細胞含量的選擇結果

2.3臨床樣本檢測結果

2.3.1對比試驗結果 經對臨床598例樣本檢測，結果顯示兩種方法共同檢出陽性42例，陰性552例。有3例北京貝爾的試劑盒檢測呈陰性，新研制的試劑檢測呈陽性。1例北京貝爾的試劑盒檢測呈陽性，新研制的試劑檢測呈陰性。經統計學分析計算，兩種方法檢測的陽性符合率為97.67%，陰性符合率為99.46%，總體符合率99.33%，Kappa值為0.951。說明新研制的試劑與已上市試劑盒檢測具有較高的一致性。見表3。

2.3.2急性感染試驗結果 30例急性感染樣本中，利用研制的試劑檢測有28例呈IgM抗體陽性。說明新研制試劑盒具有較高的敏感性和特異性。見表4。

表3 598例臨床樣本的CoxB-IgM總體檢測結果統計

注：計算方法：陽性符合率=A/(A+C)×100%；陰性符合率=D/(B+D)×100%；總符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%。

表4 30例CoxB急性感染試驗結果統計

2.3.3交叉反應試驗結果 利用新研制的試劑分別對30例MP-IgM陽性血清， 30例CP-IgM陽性血清進行檢測， 結果顯示CoxB-IgM均呈陰性。說明新研制的試劑不受其他病原體干擾，具有較好的特異性。見表5。

表5 30例MP-IgM陽性血清，CP-IgM陽性血清交叉反應試驗結果統計

3 討論

柯薩奇病毒B組是呼吸道感染的常見病原體之一，病毒根據血清型可分為B1、B2、B3、B4、B5、B6，共6種類型。可引起不同疾病包括腦炎，肺炎病毒性心肌炎等。故臨床早期快速診斷對CoxB感染的預防和治療十分重要。

目前常規用于CoxB檢測的手段包括病毒分離、血清檢查、PCR檢測等。病毒分離是最傳統的診斷方法，被認為是病原學診斷的金標準，但其耗時長、操作繁瑣、陽性率低，所以不適用于臨床檢測。PCR技術幾年來被應用于CoxB感染的檢測，其具有較高的特異性和準確性，但因其對設備和試劑的特殊需求使其醫療成本較高，不適合大范圍推廣使用[7]。

血清學常用方法是ELISA法和膠體金法，由于方法多選用基因工程抗原，其檢測敏感性和特異性較差，而我們利用的是CoxB組病毒在細胞內分泌出的特異性抗原，有效的提高了檢測的敏感性和特異性，是臨床公認的除了分離培養以外的金標準。

抗原片的制備是應用間接免疫熒光法研制CoxB-IgM抗體檢測試劑的關鍵步驟，若抗原片制備過程中出現細胞脫落，細胞病變程度不夠等情況，都會影響抗體檢測的特異性和靈敏性。本實驗室研制CoxB抗原片時，經制備條件優化實驗后，選細胞病變程度25%時制成細胞懸液，并取106/ml的細胞含量制作滴片為制備條件。經對臨床598例樣本檢測，統計學分析計算，Kappa值高達0.951，說明新研制的試劑與已上市試劑檢測具有較高的一致性；CoxB在30例MP陽性血清,CP陽性血清檢測中均呈陰性，說明新研制的試劑具有較好的特異性；30例急性感染樣本中28例被檢測出CoxB-IgM呈陽性，說明該試劑對CoxB-IgM抗體檢測具有較好的靈敏性和特異性。在上述試驗中，對比試驗中與上市試劑盒檢測不相符的幾例樣本目前考慮為是因兩種不同檢測方法的區別而產生的差異，之后可經過第三方試劑進行驗證。急性感染試驗中，有2例未檢出IgM陽性的原因可能是IgM抗體含量已經在機體內下降，轉化，不易檢出。亦或是該幾位患者為柯薩奇B組病毒其他血清型感染。

上述結果證明本實驗室研制的抗原片，可根據間接免疫熒光法的原理,與吸附劑，稀釋液和FITC標記的鼠抗人IgM抗體組合成檢測試劑，對CoxB感染患者的血清進行定性檢測。其檢出效率與上市試劑相當，且試劑的醫療成本低，操作方便，適合用于臨床初級診斷，能夠為CoxB感染的早期診斷和治療提供可靠的依據。未來可考慮根據此方法制作其他呼吸道病原體抗原片，并進一步研究和優化，實現對呼吸道感染的早期診斷及篩查。