RVP Fast與Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay聯(lián)合診斷呼吸道感染病原體

戴 蕾，鄭齊鍶，東 芳，寧明哲

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京210008)

呼吸道感染(RI) 是臨床常見疾病之一，近年來，隨著大氣環(huán)境的改變，霧霾天氣的增多，社會(huì)老齡化程度加劇，呼吸道感染的病例呈逐年上升趨勢。其臨床癥狀差異不明顯，而引起呼吸道感染的病原體很多，明確診斷病原體，合理用藥，針對性治療，才能避免抗生素的濫用和疾病的延誤[1]。傳統(tǒng)檢測呼吸道病原體檢測方法如細(xì)菌培養(yǎng)、病毒培養(yǎng)、免疫熒光和抗原檢測，存在實(shí)驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜或敏感度低等缺點(diǎn)。某些難以培養(yǎng)的細(xì)菌，如軍團(tuán)菌、百日咳等，在日常檢測中基本處于檢測盲區(qū)。本研究收集了我院呼吸道感染患者的咽拭子標(biāo)本67份，分別應(yīng)用xTAG呼吸道病毒群快速檢測(RVP Fast)與Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay 進(jìn)行病原體檢測，明確診斷病原體，為臨床合理用藥提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1材料咽拭子標(biāo)本來源于我院門診2015年3月至10月在我院呼吸科門診診斷為呼吸道感染的患者，共67份。其中，男性患者36人，女性患者31人，年齡21-92歲。

1.2儀器與試劑2720 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司) ，Luminex xMAP 200IS 儀(美國Luminex 公司)，電泳儀(美國bio-rad公司)，UTM(Universal Transport Media) 病毒采集和保存體系(意大利COPAN 公司) ，RNA 和DNA 提取試劑盒(德國Qiagen 公司) ，xTAG RVP Fast(加拿大Luminex公司) ，Seeplex PneumoBacter ACE Detection試劑盒，瓊脂糖為BIOWEST REGULAR GAROSE G-10。

1.3RNA與DNA提取使用Qiagen公司核酸提取試劑盒。

1.4RVPFast檢測按照試劑盒說明書及文獻(xiàn)[2,3]報(bào)道，先PCR擴(kuò)增19個(gè)亞型的呼吸道病毒基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記特異探針的磁珠混合液雜交，雜交產(chǎn)物在xMAP 200IS 儀器上檢測熒光信號強(qiáng)度中位數(shù)值(MFI) ，應(yīng)用配套軟件分析檢測結(jié)果。檢測設(shè)空白對照以確認(rèn)是否污染，設(shè)置lambda 噬菌體為陽性質(zhì)控，噬菌體MS2 RNA 為內(nèi)參照。

1.5SeeplexPneumoBacterACEDetectionassay檢測按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系：5× PB ACE PM 4 μl，2× Multiplex Master Mix 10 μl，8-MOP Solution 3 μl，DNA模板 3 μl，共20 μl。反應(yīng)條件：94℃，15 min；94℃，30 s，60℃ 90 s，72℃ 90 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈照射成像，根據(jù)產(chǎn)物位置判斷病原體類型。

2 結(jié)果

2.1RVP Fast共檢測標(biāo)本67份，陽性標(biāo)本4例，陽性率為5.97%，其中腸鼻病毒2例，流感A型病毒1例，呼吸道合胞病毒(RSV)1例。見表1。

表1 檢出病毒標(biāo)本詳細(xì)列表

2.2Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay檢測標(biāo)本67份，陽性標(biāo)本26份，陽性率38.81%。其中，單病原體感染者14名，男10名，女4名；雙病原體感染者12名，男5名，女7名。檢出肺炎鏈球菌7例，流感嗜血桿菌8例，肺炎支原體5例，肺炎衣原體9例，百日咳鮑特桿菌4例，軍團(tuán)菌5例。見表2及圖1。

表2 檢出的病原體分布

注：泳道7為 PB ACE MARKER。泳道1、2、4、5、11為肺炎鏈球菌陽性，泳道9為流感嗜血桿菌陽性，泳道12為肺炎衣原體陽性

圖1PCR產(chǎn)物(Seeplexace試劑盒)電泳圖

3 討論

成人呼吸道感染的病原體檢測日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。尤其近年來由于霧霾天氣日益增多，大氣環(huán)境的改變，成人呼吸道感染患者逐步增加。而且各類抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌感染發(fā)生率有所降低，使得由病毒和非典型性病原體(肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團(tuán)菌) 引起的肺炎和支氣管炎相對突出。呼吸道病原體致病性強(qiáng)、傳播快、起病急，人群不易形成持久抵抗力，臨床特征缺乏特異性，容易造成抗生素的濫用，給疾病的診治及防控造成一定的困難[5]，(肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團(tuán)菌) 引起的肺炎和支氣管炎相對突出。呼吸道病原體致病性強(qiáng)、傳播快、起病急，人群不易形成持久抵抗力，臨床特征缺乏特異性，容易造成抗生素的濫用，給疾病的診治及防控造成一定的困難[5]，且呼吸道病原體在不同的季節(jié)、不同地區(qū)和不同人群中流行性也不盡相同[6]。因此對本地區(qū)成人呼吸道感染的病原學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查和研究顯得尤為重要。

xTAG=呼吸道病毒群快速檢測(RespiratoryViral Panel RVP Fast Array，RVP Fast) 為代表的液相多重檢測技術(shù)能在同一反應(yīng)體系同時(shí)檢測流感病毒(甲、乙型，甲型H1、H3 亞型及未知亞型) ，呼吸道合胞病毒(A、B 型) ，冠狀病毒(OC43 亞型、NL63 亞型、229E 亞型和HUK1 亞型) ，副流感病毒(1-4型) ，人類偏肺病毒，腸道/鼻病毒，腺病毒和人博卡病毒共8 個(gè)種屬19 個(gè)型別。有關(guān)研究評估了RVP Fast 方法篩查呼吸道病毒的效能[2,3,6]，但國內(nèi)目前尚未在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。本研究中，67份標(biāo)本檢測陽性率為5.97%，低于文獻(xiàn)報(bào)道的20.9%-35.4%。但兩種研究方法不同，本研究應(yīng)用的為PCR后流式熒光免疫分析技術(shù)，而文獻(xiàn)6中使用的為德國歐蒙公司的間接免疫熒光(IIF)法，且本研究例數(shù)較少，而且操作相對繁瑣，干擾因素多，對結(jié)果有一定的影響。因此，本法暫僅用于臨床研究，不適合在醫(yī)院推廣。

Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay一次檢測七種非典型肺炎的病原體，包括肺炎支原體、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳鮑特桿菌、流感嗜血桿菌。相比于RVP Fast檢測，此方法耗時(shí)少，且陽性率高。普通PCR也可檢測此類病原體，但一次僅能檢測一種病原體，此方法可一次檢測六種病原體，提高檢出率，幫助臨床明確診斷。細(xì)菌培養(yǎng)可檢出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，但其為苛養(yǎng)菌，形態(tài)與正常菌群相似，不易分辨，檢出率低。此技術(shù)的推廣，可提高此兩種病原體的檢出率，耗時(shí)較細(xì)菌培養(yǎng)短。目前，大多數(shù)醫(yī)院微生物室均不能培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳鮑特桿菌，使得這兩種細(xì)菌的診斷處于盲區(qū)。此技術(shù)的使用與推廣，為臨床提供明確的診斷，合理使用抗生素提供依據(jù)。