GDNF在成人脂肪基質(zhì)細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化中的作用

歐 亞，元小冬，張麗麗

(華北理工大學(xué)附屬開(kāi)灤總醫(yī)院，河北 唐山063000)

神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念。目前研究資料表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，它不僅可以在體外分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等中胚層來(lái)源的細(xì)胞，而且還可以橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，成為研究神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的靶向細(xì)胞[1,2]。而作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多、體積最大的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等活性物質(zhì)在腦內(nèi)廣泛分布，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有一定的營(yíng)養(yǎng)作用，在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)損傷修復(fù)和維持正常的腦功能中有重要意義[3,4]。其中，膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)作為GDNF家族中首次被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在多種膠質(zhì)細(xì)胞中，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞中充分表達(dá)[5]。其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性較高，不僅可以在保護(hù)多巴胺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元方面發(fā)揮作用，同時(shí)，對(duì)于中樞及外周的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、交感神經(jīng)元等具有同等的營(yíng)養(yǎng)作用。本研究通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞的GDNF檢測(cè)，探討在此過(guò)程中形成的星形膠質(zhì)細(xì)胞是否具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能，以及GDNF對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程所起到的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)取材本研究所用的脂肪組織為華北理工大學(xué)附屬開(kāi)灤總醫(yī)院美容整形中心和唐山金榮整形美容醫(yī)院健康成人腹部皮下吸脂整形術(shù)后的脂肪組織廢棄物。此項(xiàng)研究經(jīng)志愿者同意并經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2ADSC的體外提取、培養(yǎng)脂肪組織取材后，應(yīng)用Ye等人[6]的方法，將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隨后每3天換液1次，大約在10-14天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，按照1∶2比例進(jìn)行傳代，之后繼續(xù)應(yīng)用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3-6代ADSC，制成細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右融合時(shí)，開(kāi)始應(yīng)用以IBMX為主要成分的化學(xué)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)分化[7]，依據(jù)誘導(dǎo)分化反應(yīng)時(shí)間分別分為誘導(dǎo)48 h組、誘導(dǎo)7 d組、誘導(dǎo)14 d組、誘導(dǎo) 21 d組。同時(shí)，選取按常規(guī)培養(yǎng)無(wú)誘導(dǎo)劑的未誘導(dǎo)細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.4光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下觀察未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)48 h、7 d、1 4d和21 d時(shí)的細(xì)胞形態(tài)并攝片。消化、離心收集誘導(dǎo)分化48 h的成人ADSC。3%戊二醛、1%餓酸固定，丙醛脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片，2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、拍照記錄。未誘導(dǎo)的ADSC作為對(duì)照。

1.5免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共表達(dá)取未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后48 h、7 d、14 d、21 d細(xì)胞制作爬片，行免疫熒光GFAP、GDNF染色及GFAP和GDNF共染色。一抗分別為鼠抗人GFAP單克隆抗體、兔抗人GDNF多克隆抗體及二者的混合工作液。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察并攝片。GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)為棕黃色，GDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)為綠色，GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)為黃色。計(jì)算GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2003 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成人ADSC的原代及傳代培養(yǎng)

剛提取的成人ADSC呈類(lèi)圓形、黑點(diǎn)狀，于體外培養(yǎng)24 h內(nèi)開(kāi)始貼壁，而未貼壁細(xì)胞為圓形亮點(diǎn)狀，之后隨逐漸換液脫離培養(yǎng)瓶。貼壁細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸伸展，由圓形、類(lèi)圓形逐漸伸展為短梭形或多角形，胞核居中，可見(jiàn)1-2個(gè)核仁(圖1a)。培養(yǎng)48 h時(shí)，多數(shù)ADSC胞體變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈類(lèi)似于成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。7-10 d左右細(xì)胞增殖速度加快，鏡下可見(jiàn)大量梭形細(xì)胞呈漩渦狀排列，細(xì)胞生長(zhǎng)到14 d可達(dá)到90%融合。傳代后12 h內(nèi)細(xì)胞基本貼壁，24 h呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。傳至第3-6代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)基本均勻，呈長(zhǎng)梭形(圖1b)，雜質(zhì)細(xì)胞基本去除，此時(shí)細(xì)胞增生活躍，3-6天即可鋪滿整個(gè)瓶底。

2.2ADSC誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

誘導(dǎo)至5 h時(shí)，ADSC形態(tài)逐漸開(kāi)始發(fā)生變化，胞體折光性逐漸增強(qiáng)，胞質(zhì)以胞核為中心向內(nèi)回縮，ADSC的原始外部胞膜輪廓逐漸模糊。16 h左右細(xì)胞胞體折光性顯著增強(qiáng)，呈圓形或多邊形，胞漿回縮更為明顯。低倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞伸出多條突起，但高倍鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞這些突起為胞漿不均勻回縮所致，且某些細(xì)胞仍能看到ADSC細(xì)胞膜的原始外部輪廓(圖2a)。48 h，光鏡下可見(jiàn)典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，即胞體圓形，伸出多條細(xì)長(zhǎng)突起，部分一級(jí)突起伸出多條次級(jí)突起，胞核圓形，居中，可見(jiàn)到1-2個(gè)核仁，但部分細(xì)胞的突起末端分化不完全(圖2b)。此后至誘導(dǎo)后14 d，細(xì)胞形態(tài)基本保持不變(圖2c)。21 d時(shí)，胞體折光性減弱，呈三角形或不規(guī)則形，部分突起回縮，僅有2-3條較短突起。28 d時(shí)，大量細(xì)胞脫落、死亡。

圖a為原代培養(yǎng)3 d時(shí)細(xì)胞，貼壁細(xì)胞呈黑點(diǎn)狀；b為成人ADSC傳代至第3代3 d時(shí)，成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，并呈旋渦狀生長(zhǎng)。

圖1成人ADSC原代及傳代培養(yǎng)后倒置相差顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)變化特征

圖a箭頭所示為未分化完全細(xì)胞；圖b為誘導(dǎo)后48h細(xì)胞；圖c為誘導(dǎo)后14 d細(xì)胞。

2.3成人ADSC在誘導(dǎo)后的超微結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡下可見(jiàn)，經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體基本呈圓形或橢圓形，表面有較多突起；核呈卵圓形(圖3a)，具有1-2個(gè)核仁，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少；胞質(zhì)中可見(jiàn)較多核糖體及溶酶體，有大量交錯(cuò)排列的膠質(zhì)原纖維(圖3b)。

2.4誘導(dǎo)后細(xì)胞GFAP、GDNF免疫熒光表達(dá)

未誘導(dǎo)ADSC無(wú)GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞。誘導(dǎo)后開(kāi)始出現(xiàn)GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞，且GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，誘導(dǎo)7 d時(shí)GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比達(dá)到峰值(P<0.05)，誘導(dǎo)14 d時(shí)GFAP、GDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比達(dá)到峰值(P<0.05)，之后逐漸下降。相同時(shí)間點(diǎn)比較，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分比>GDNF陽(yáng)性細(xì)胞百分比>FAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比，P<0.05。見(jiàn)表1。

圖b箭頭所示為星形膠質(zhì)細(xì)胞中的膠質(zhì)原纖維結(jié)構(gòu)。

圖(a1)-(e4)分別為未誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)48h、7d、14d和21d組細(xì)胞GFAP、GDNF和GFAP/GDNF的表達(dá)結(jié)果。綠色為GFAP陽(yáng)性表達(dá)部位，紅色為GDNF陽(yáng)性表達(dá)部位，藍(lán)色細(xì)胞核，黃色為GFAP和GDNF陽(yáng)性共表達(dá)部位。

圖4ADSC誘導(dǎo)后GFAP、GDNF免疫熒光表達(dá)

表1 誘導(dǎo)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比

注：各組之間GFAP陽(yáng)性率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，各組之間GDNF陽(yáng)性率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，各組之間GFAP/GDNF共表達(dá)率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。誘導(dǎo)48 h組的GFAP/GDNF共表達(dá)率小于該組的GFAP表達(dá)陽(yáng)性率和GDNF表達(dá)陽(yáng)性率，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；誘導(dǎo)7 d、14 d和21 d組的細(xì)胞同樣存在此種現(xiàn)象。

3 討論

以阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)為代表的神經(jīng)退行性疾病是目前嚴(yán)重影響人類(lèi)生存和生活質(zhì)量的一大類(lèi)常見(jiàn)疾病。而神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)元不能再生的傳統(tǒng)觀念。國(guó)內(nèi)外有研究者已將ADSC成功誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等各種神經(jīng)細(xì)胞[8-14]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多、具有重要功能的細(xì)胞，可以通過(guò)分泌多種神經(jīng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)修復(fù)作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等活性物質(zhì)在腦內(nèi)廣泛分布，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有一定的營(yíng)養(yǎng)作用，在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)損傷修復(fù)和維持正常的腦功能中有重要意義。星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌的多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)等。其中GDNF是眾多學(xué)者研究最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，該種神經(jīng)因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛,在個(gè)體的整個(gè)發(fā)育期都有廣泛的表達(dá)。GDNF因來(lái)源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且最早由Lin等[15]從大鼠膠質(zhì)細(xì)胞B49的條件培養(yǎng)液中分離出來(lái)，故被命名為膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。有研究表明，GDNF可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可以增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化[16,17]。我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由ADSC誘導(dǎo)分化而來(lái)的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸升高，誘導(dǎo)7 d時(shí)GFAP/GDNF共染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比達(dá)到峰值，說(shuō)明此時(shí)分化成功的星形膠質(zhì)細(xì)胞最具功能代表性，同時(shí)不斷分泌GDNF，此后在相對(duì)于初始誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)環(huán)境中，GDNF的濃度明顯增高，我們推測(cè)這又間接促使ADSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。誘導(dǎo)14 d時(shí)GFAP、GDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比達(dá)到高峰，即在不斷新生星形膠質(zhì)細(xì)胞的同時(shí)，GDNF也逐漸增高，二者互相影響，直至14 d后二者比例下降。但有報(bào)道顯示，GDNF可以部分抑制細(xì)胞周期蛋白，從而阻止細(xì)胞增生進(jìn)程[18]，這是否是導(dǎo)致減少誘導(dǎo)14 d后星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的原因目前還不得而知。