siRNA沉默HOTAIR表達對人膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響

郭志鋼,王 涵,王 冠,李妍哲,田 宇,李朝暉*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 神經外二科，吉林 長春130033； 2.長春中醫藥大學附屬醫院 檢驗科，吉林 長春130010)

HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是一種典型的反義長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,IncRNA)，其在多種腫瘤中表達異常增高。HOTAIR在腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移中發揮重要的作用[1-3]。有研究發現，膠質瘤中HOTAIR呈高表達，但在膠質瘤中的作用機制尚不明確[4]。本研究通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制膠質瘤細胞A172中HOTAIR的表達，觀察HOTAIR下調后對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響，進一步揭示HOTAIR在膠質瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

DMEM培養基購于南京凱基生物科技發展有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DMSO和MTT購自杭州昊天生物公司，Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。細胞周期DNA含量檢測試劑盒和Lipofectamine2000購自南京凱基生物技術股份有限公司。

1.2細胞培養

人膠質瘤細胞A172和人星形膠質細胞HA1800均購自中科院上海細胞所。A172細胞和HA1800細胞培養于含青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL 、10%滅活胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃和5%CO2的培養箱中培養，0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

Trizol試劑提取總RNA。檢測RNA濃度，HiFi-MMLV cDNA試劑盒合成第一鏈cDNA。

逆轉錄產物用SYBR試劑盒進行熒光定量PCR反應，β-actin作為內參基因。 HOTAIR引物，上游：5’- CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’，下游：5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’。β-actin引物，上游：5’-GGCACCACACCTTCTACAAT-3’，下游：5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’。real-time PCR反應條件：95℃，10 min；94℃，30 s， 58℃，30 s，72℃，60 s，40個循環；72℃，10min。qRT-PCR結果利用2-△△Ct法進行計算分析。

1.4si-HOTAIR轉染

si-HOTAIR序列為5’-GCGCCUUCCUUAUAAGUAUTT-3’，陰性對照(negative control,NC)序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。Lipofectamine 2000 試劑轉染，qRT-PCR方法檢測轉染效率。實驗分si-HOTAIR組、NC組及空白對照組(Blank)。

1.5MTT法檢測細胞增殖率

取對數生長期的細胞，以2×104/ml的密度接種在96孔培養板上，每孔100 μl。細胞增至50%-60%時轉染siRNA，培養箱中繼續培養。采用MTT法測定細胞生長活性，以570 nm波長吸光度OD值表示，計算細胞增殖率。細胞增殖率=處理組OD值/對照組OD值。

1.6Guava微流式細胞分析儀檢測細胞周期

收集細胞，用PBS洗滌，加入700 mL/L乙醇1 ml，固定過夜。第2 天離心去除乙醇，以含2 g/L PI的PBS 500 μl重懸，避光繼續孵育30 min，過200目細胞篩后。利用Guava easy Cyte 8微流式細胞分析儀檢測細胞周期。

1.7Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

無血清培養基以8∶1的比例稀釋Matrigel膠，均勻鋪于Transwell小室，每孔50 μl，37℃反應30 min。各組細胞以5×104個/孔接種于Transwell小室，在含5%CO2的培養箱中37℃連續培養24 h。用濕棉棒擦去上室底部膜表面上的細胞，然后揭下底部膜，底部向上晾干。最后移至載玻片上，用中性樹膠封片。顯微鏡下隨機取9個視野計數，統計結果。

1.8統計學方法

2 結果

2.1HOTAIR在膠質瘤細胞及正常膠質細胞中的表達分析

qRT-PCR方法檢測正常星形膠質細胞HA1800和膠質瘤細胞A172中HOTAIR mRNA的相對表達量。檢測結果顯示，HOTAIR mRNA在HA1800和A172中的表達量分別為1.12±0.08和2.67±0.03，膠質瘤細胞中HOTAIR表達較正常星形膠質細胞顯著增加(P<0.01，圖1)。

2.2膠質瘤細胞A172中si-HOTAIR瞬時轉染效率檢測

利用qRT-PCR檢測轉染24 h、48 h及72 h后HOTAIR mRNA的表達水平，以驗證轉染si-HOTAIR后A172細胞中HOTAIR基因表達的抑制情況。結果顯示，NC組與Blank組相比無統計學差異，si-HOTAIR組與NC組相比較，轉染24 h、48 h及72 h后A172細胞中HOTAIR mRNA的表達水平分別下降(38.27±3.52)%、(70.16±0.57)%和(81.54±0.41)%，有顯著性差異(P<0.01，圖2)。結果說明si-HOTAIR轉染顯著降低細胞中內源表達的HOTAIR，可用于后續實驗研究。

2.3MTT法檢測si-HOTAIR對A172膠質瘤細胞增殖的影響

MTT結果發現，NC組與Blank組相比，轉染24 h、48 h和72 h后細胞增殖率均無明顯變化(P>0.05)。si-HOTAIR組與Blank組相比，在轉染24 h后細胞增殖率無明顯變化(P>0.05)，在轉染48 h和72 h后細胞增殖率分別下降(15.38±0.39)%(P<0.05)和(27.54±2.32)%(P<0.01)，有統計學意義(圖3)。

圖1HOTAIR在A172和HA1800中的表達結果圖2siHOTAIR瞬時轉染A172細胞后HOTAIR的表達情況圖3HOTAIR表達量降低對A172膠質瘤細胞增殖的影響

2.4流式細胞術檢測si-HOTAIR對膠質瘤細胞A172細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，轉染si-HOTAIR后，膠質瘤A172細胞中G0/G1期細胞逐漸增加，S期相對減少，且這一效果隨著時間的延長更加顯著(圖4)。結果表明，si-HOTAIR能夠抑制膠質瘤細胞從G0/G1期向S期轉變。

2.5Transwell檢測si-HOTAIR對A172膠質瘤細胞侵襲的影響

收集si-HOTAIR轉染48 h后的A172細胞，轉移至Transwell小室繼續培養24 h，固定染色，顯微鏡下觀察。si-HOTAIR組穿過小室基底膜的紫色細胞數量明顯少于NC組及Blank組(圖5)。取9個隨機視野計數，結果顯示，Blank組、NC組及si-HOTAIR組的穿膜細胞數分別為76.8±2.4、71.2±5.6和36.1±1.5，具有顯著統計學差異(P<0.01)，si-HOTAIR組細胞侵襲能力顯著低于Blank組及NC組。結果表明，si-HOTAIR能夠降低膠質瘤細胞的侵襲能力。

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，盡管其治療已發展為手術、放療和化療相結合的綜合治療模式，預后仍極差，其中膠質母細胞瘤的中位生存期僅為14.6個月[5]。因此，更加深入的研究膠質瘤的發病機制是亟待解決的問題。越來越多的研究表明，IncRNA參與膠質瘤的發生發展過程，IncRNA可通過調節DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重構等多種途徑，在膠質瘤的發病機制中扮演重要角色[6]。

HOTAIR是一種典型的IncRNA，也是第一個被發現具有反式轉錄作用的IncRNA，基因位于人類染色體12q13.13區同源框基因家族Hoxc11基因座的反義鏈。HOTAIR的生物學作用是通過募集一系列復雜蛋白復合體實現對下游靶標癌基因和抑癌基因的調控，主要功能體現在調節蛋白編碼基因的表觀遺傳，如調節H3K27me3組蛋白的修飾、調節PTEN基因啟動子區域的甲基化水平[7]。HOTAIR在乳腺癌、多發性骨髓瘤、肝癌等多種腫瘤的增殖、侵襲及轉移中發揮重要作用，并且與臨床預后密切相關[8,9]。

圖4 HOTAIR表達量降低對細胞周期的影響

圖5 si-HOTAIR轉染后A172細胞侵襲能力檢測

HOTAIR在膠質瘤中發揮的具體作用目前尚不清楚，本研究通過體外細胞實驗，對HOTAIR在膠質瘤細胞增殖和侵襲中的作用進行探討。首先利用qRT-PCR檢測到HOTAIR在膠質瘤細胞A172中的表達水平較正常星形膠質細胞HA1800中明顯增高。為進一步明確HOTAIR在膠質瘤增殖和侵襲中的作用，我們采用siRNA沉默基因表達的方法，合成si-HOTAIR，利用脂質體瞬時轉染法轉染至A172細胞，qRT-PCR方法驗證si-HOTAIR可以明顯下調HOTAIR的表達水平。采用MTT法、流式細胞術和Transwell侵襲實驗分別檢測抑制HOTAIR的表達對人膠質瘤A172細胞增殖、周期及侵襲能力的影響。MTT結果發現，HOTAIR表達下調的A172膠質瘤細胞增殖明顯受到抑制，細胞周期實驗發現下調HOTAIR表達可以阻滯膠質瘤細胞從G0/G1期向S期轉換，同時，Transwell實驗結果發現HOTAIR表達下調后A172細胞的侵襲能力明顯降低。

本研究結果表明，下調HOTAIR表達能夠抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力，HOTAIR有望成為膠質瘤基因治療的潛在靶點。