TRIM44對膀胱腫瘤生長及轉移的影響

王新勝，王琳琳，姜福全*

(1.天津市第一中心醫院 泌尿外科，天津300192;2.吉林大學中日聯誼醫院)

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤，大多數患者為非肌層浸潤性，其侵襲能力較強，手術是其主要治療手段，但術后易復發且伴有向肌層浸潤性發展可能[1,2]。因此，目前亟待探索膀胱腫瘤轉移的分子機制及尋找有效的方法治療膀胱腫瘤的方案，以期提高患者生存率及生活質量。TRIM44(Tripartite motif-44，三重基序蛋白-44) 是TRIM家族的一員[3]，已有研究發現TRIM44在多種腫瘤的過表達參與調節細胞增殖、調控細胞周期進展促進腫瘤發生，使腫瘤具有更強的侵襲遷移能力及促血管生成導致腫瘤的轉移。血管擬態觀察微血管密度是評估腫瘤生長、復發、轉移、預后的指標，具有重要的臨床實用價值[4]。本研究將利用脂質體轉染si-TRIM44到膀胱癌T24和5637細胞中，探討敲降TRIM44表達對于膀胱癌細胞的生長、轉移、侵襲及血管生成的作用，為進一步研究TRIM44作為靶向治療膀胱腫瘤的重要分子奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料MTT、細胞生長周期試劑盒(碧云天生物技術研究所)；細胞培養相關試劑；Transwell小室(Corning 公司)；Matrigel 基底膜(BD bioscience)；Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)；Western Blot相關試劑(碧云天生物技術研究所)；抗人TRIM44單克隆抗體(Santa公司)；

1.2細胞培養及轉染T24、5637細胞培養于含有10% 胎牛血清及1%鏈霉素和青霉素的DMEM完全培養基，置于5%CO2、37℃培養箱中。構建si-TRIM44小干擾RNA，應用脂質體Lipofectamine 2000將構建的si-RNA分別轉染至T24和5637細胞中。本研究分組：si-NC空白對照組，si-TRIM44實驗組。

1.3MTT檢測細胞增殖情況取生長狀態較好，處于對數生長期的細胞，種植于96孔板中。待細胞生長至90%融合時，利用脂質體轉染，于轉染后72小時，每孔加入20 μl 10%MTT溶液，避光培養4小時，棄上清后加入100 μl DMSO，在避光的條件下充分振蕩，利用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光光度值，重復3次，統計分析后觀察細胞增殖情況。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期取6孔培養板中細胞，分別轉染si-TRIM44及si-NC48h后，常規胰酶消化細胞，吹懸成單細胞懸液，1 000 rpm離心5分鐘收集細胞，PBS沖洗細胞后加入75%乙醇，-20℃固定過夜。4℃ 1 000 rpm離心去除乙醇，加入500 μl PI染色液，37℃避光孵育30分鐘，應用流式細胞儀檢測，應用ModFit軟件分析，測定并計算細胞周期中各期細胞的百分數。

1.5Transwell小室檢測細胞侵襲及轉移取24孔細胞培養板，每孔加入600 μl含20%FBS的DMEM培養液，將transwell小室置于其中，將細胞懸液200 μl(細胞濃度達到1×105/ml)加入上層小室，置于細胞培養箱內。24小時后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫溶液染色，每張膜隨機選取5個視野，倒置顯微鏡下計數每個視野內的細胞數并拍照保存。Transwell侵襲實驗采用將Transwell小室膜的上層均勻覆蓋Matrigel基質膠，其余步驟同遷移實驗。

1.6血管生成擬態(VM)的觀察將300 μl預冷的Matrigel加入24孔細胞培養板，避免氣泡產生，置于37℃培養箱30 min使其凝固。胰酶消化各組細胞，每孔內接種1 ml濃度為5×105/mL細胞懸液，5%CO2、37℃培養12小時。倒置顯微鏡下觀察細胞形成的網狀結構，取5個視野照相記錄管狀結構的完整程度和數量。

1.7統計分析統計學方法采用SPSS17.0進行t檢驗，數值用均值和標準差表示，P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞中TRIM44的表達檢測

利用q-PCR和Western Blot 方法分別檢測正常膀胱上皮細胞(SV-HUC-1)和膀胱癌細胞系(T24和5637)中TRIM44的表達情況，如圖1所示，在mRNA和蛋白質水平，T24和5637細胞中TRIM44的表達水平明顯高于SV-HUC-1細胞(*P<0.05)。

圖1 細胞中TRIM44的表達情況

2.2TRIM44敲降后膀胱癌細胞的表達檢測

應用q-PCR和Western Blot方法檢測轉染si-RNA及其對照si-NC后膀胱癌細胞系(T24和5637)中TRIM44的表達情況，如圖2所示，在mRNA和蛋白質水平，可見轉染si-TRIM44組細胞比轉染si-NC組細胞中TRIM44 表達明顯下調(**P<0.001)，表明轉染si-TRIM44敲降效果的有效性。

圖2 轉染si-TRIM44后細胞中TRIM44的表達情況

2.3敲降TRIM44的表達可抑制膀胱癌細胞的增殖

利用MTT檢測結果顯示，si-TRIM44轉染組與對照組相比，敲降TRIM44的表達使細胞增殖活性明顯減慢，差異具有統計學意義(*P<0.05，見圖3)，可見干擾TRIM44能夠抑制膀胱癌細胞的生長。

2.4敲降TRIM44的表達阻滯膀胱癌細胞生長周期的進展

利用流式細胞儀檢測細胞生長周期變化，si-TRIM44轉染組與對照組相比，敲降TRIM44的表達使兩組膀胱癌細胞均出現了明顯的G0/G1期阻滯，S期細胞減少，差異具有統計學意義(*P<0.05，**P<0.001,見圖4)。

圖3 TRIM44對膀胱癌細胞增殖的作用

圖4 TRIM44對膀胱癌細胞生長周期的作用

2.5敲降TRIM44的表達抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲

通過對比Transwell小室中加入或不加入Matrigel膠發現，si-TRIM44轉染組細胞遷移和侵襲數量明顯低于對照組(**P<0.001，見圖5)，表明TRIM44可促進膀胱腫瘤的遷移和侵襲。

圖5 TRIM44對膀胱癌細胞遷移、侵襲的作用

2.6敲降TRIM44的表達抑制血管生成

顯微鏡照相記錄轉染細胞組中血管擬態管狀結構的排列情況，我們觀察到對照組可見明顯的擬血管狀結構出現，而si-TRIM44組無明顯血管形成，通過計數對比發現si-TRIM44轉染組細胞擬血管成管能力明顯低于對照組(*P<0.05，**P<0.001，見圖6)。

圖6 TRIM44對膀胱癌細胞血管生成擬態的作用

3 討論

本研究中，我們利用基因轉染使TRIM44在膀胱腫瘤細胞中低表達，研究發現TRIM44基因能促進膀胱腫瘤細胞生長，遷移及侵襲，促進血管的生成，TRIM44低表達抑制腫瘤的生長和轉移。

以往研究證實，TRIM44具有保守的環指結構、B-BOX 結構以及超螺旋結構域[5]，在惡性腫瘤的發展過程中具有重要的調節作用。TRIM44 在胃癌[6]、前列腺癌[7]、乳腺癌[8]、睪丸腫瘤[9]等多種腫瘤中表現出過度表達狀態，過度表達的TRIM44可促進腫瘤生長，促進腫瘤轉移，其分子機制可能與激活mTOR、NF-κB信號通路有關[10,11]。沉默TRIM44基因的表達抑制Wnt/β-catenin 通路從而抑制甲狀腺癌的發生[12]。TRIM44的高表達促進腫瘤發生過程中上皮間質轉化的發生，其分子機制與AKT/mTOR通路的激活及下游STAT3的磷酸化活化有關[13]。本研究發現TRIM44基因在膀胱癌中能夠促進細胞增殖，促進細胞周期進展，促進血管的形成，促進細胞的侵襲和遷移。腫瘤細胞增殖是惡性腫瘤的重要特征，本試驗的研究結果發現,敲降TRIM44可明顯降低腫瘤細胞的增殖。腫瘤細胞遷移能力增強促進腫瘤發生遠處轉移，通過Transwell小室細胞遷移實驗我們得知si-TRIM44組遷移細胞的數量明顯減少，加入Matrigel膠可模擬腫瘤侵襲狀態，沉默TRIM44抑制了腫瘤的侵襲及轉移能力。TRIM44在膀胱腫瘤中發揮著致癌基因的作用，沉默其表達可抑制膀胱腫瘤的增殖、侵襲及遷移能力。

在本研究中，我們的成果顯示，特異性干擾TRIM44可以抑制膀胱腫瘤的生長及遷移，初步發現TRIM44可作為膀胱腫瘤基因治療的候選基因，有利于闡明膀胱腫瘤的生長及轉移的分子機制，為基因靶向治療膀胱腫瘤的進一步研究奠定基礎，同時也為膀胱腫瘤患者的個體化治療提供了新線索。