食品檢測中分子檢測技術的應用及實驗室管理

何微 岳苑 賈冰凝

摘 要：隨著科學技術的發展，分子生物學檢測技術已成為現代食品檢測行業中的重要分支。近些年我國對食品的質量愈發重視，實時熒光定量PCR技術憑借著其高效、迅速、精準的優勢已成為食品安全檢測技術中的中流砥柱，進入了新階段。本文對食品檢測中實時熒光定量PCR技術的應用以及分子生物學實驗室的安全隱患進行了分析與總結，提出了有效的管理對策，確保了檢測環境與數據的安全。

關鍵詞：分子生物學檢測技術 實時熒光定量PCR 實驗室安全

中圖分類號：TS20 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）04（b）-0133-03

眾多數據顯示，實時熒光定量PCR技術由于其不可替代的優點，加之近年來各地科技攻關均把醫療衛生領域中的食品安全作為重要的優先研究領域，因此該技術被廣泛應用于各類食品的微生物檢測、動物源性食品摻假技術的檢測以及食品的轉基因狀況檢測等等。大量研究表明微生物與分子生物學檢測技術是食品中致病菌以及摻假情況檢測的基礎和支撐。黨的十八大之后，國家食品藥品監督管理總局對食品檢測領域不斷進行擴項，使得各檢測機構分子生物學實驗室在改進檢測技術，優化檢測方法的同時也不斷擴大實驗室規模，完善檢測的硬件設施，但也因此加大了分子生物學實驗室管理難度。分子實驗室在給我們檢測提供便捷的同時，其中所包含的高毒、易燃、易爆、強氧化物質[1]也給我的檢測工作帶來了困擾，近期不斷報道的各類生物安全事故[2]，更警示著我們實驗室安全不可松懈。

本文通過介紹近年來實時熒光定量PCR技術在食品檢測領域的應用，并總結近年來國內外生物實驗室發生的安全事故，針對具體檢測情況，探究子分生物實驗室所應具備的安全管理準則。

1 實時熒光定量PCR技術概括

1.1 實時熒光定量PCR技術的原理

PCR反應技術是模擬體內DNA復制的原理在體外促和成特異DNA片段的一種方法[1]，實時熒光定量PCR技術則是根據所添加的熒光基團所產生的熒光信號的變化實監測每一個循環擴增產物量的變化，具體檢測過程中的定量分析是根據循環閾值（Ct）和標準曲線的分析進行的。根據不同的熒光標記類型可以將RT-PCR技術分為探針類和非探針類，研究表明，探針類標記的特異性更高，應用更廣。

1.2 非探針類法（熒光染色法）

眾多的熒光染料中SYBR Green1由于其操作簡單（無須脫色或沖洗），染色的凝膠樣品熒光信號強，背景信號低，因此是應用最為廣泛的。有數據表明熒光染色法至少可檢出20pg DNA，這高于EB染色法的25～100倍。此外還有LC Green TM1和Pico Green等新型熒光染料，當PCR擴增的時候，所添加的染料結合到DNA上[3]，則會產生熒光信號，便于研究者的有效收集。但實踐證明，染料法雖然成本低，可其特異性不強，他會與所有的雙鏈的DNA相結合，從而產生熒光，這大大降低了熒光染色法的檢測精度[4]。

1.3 熒光探針法

探針法則避開了熒光染色法的不足，在對模板進行擴增時，除引物外再添加一個特異性的探針，此探針的兩端具有發光和淬滅兩個基團，當DNA通過引物進行合成的時，探針折斷，其兩端的基團均被釋放，此時實時熒光定量PCR儀通過收集發光基團產生熒光，從而對檢測基因進行定量[5]。目前食品檢測過程中應用最多的為TaqMan探針技術[6]，在擴增過程中，每一次模板的復制就伴隨著一個探針的斷裂，并同時釋放一個熒光信號，隨著產物的增加，熒光信號也跟著不斷加強，將不同的模板擴增的Ct值和標準模板數的對數值擬合成標準曲線，從而準確推斷出起始模板的數量。

除此之外，我們還有ScorpionsTM/AmplifluorTM （雜交探針）、LUX（雜交探針）、Universal probe library-LNA （ locked nucleic acids水解探針）、Simple probe探針、Dual-oligo FRET pairs（雙雜交探針）等探針技術[7]。

1.4 實時熒光定量PCR法在食品檢測方面的應用

實時熒光PCR 技術有效減少擴增產物的交叉污染[8]，加之其可以直接定量，查看濃度，這就避免了傳統PCR檢測時所需的電泳及相關色劑對檢測人員造成傷害。因此該檢測方法被廣泛應用在對食品中的致病菌進行檢測的環節中[9]，相比較傳統的按部就班的微生物檢測辦法，實時熒光定量PCR法更為快速、敏感[10]。

轉基因食品近年發展十分迅速，但其所產生的食品安全性問題也成為公眾關注的焦點，隨著人們食品安全需求的日益增加，目前對食品轉基因檢測已從定性提高到定量水平。當前對轉基因食品檢測技術路線主要有兩條：一是對外源基因表達產物蛋白質進行檢測；二是直接檢測外源基因DNA。與此同時，熒光定量PCR技術還可應用于食品中摻假問題的檢查。

以上種種表明，實時熒光定量PCR技術在檢驗過程中必不可少，因此為了保障工作的順利開展，我們不僅要熟練掌握分子檢測技術，更應保障分子實驗室的安全。

2 分子實驗室的安全

2.1 分子實驗室安全隱患分析

根據國內外分子生物學實驗室安全事故的報道[11]，本文將分子安全隱患主要歸結為以下幾個方面。

2.1.1 實驗危險試劑及檢驗廢棄物

日常食品的微生物和分子生物學檢驗過程中因為涉及到均質、稀釋、培養、擴增等步驟，因此常常會產生一些廢液、培養物及固體廢棄物等，其中很多廢棄物具有生物安全隱患[12]；其尤其是利用實時熒光定量PCR技術對食品中的微生物進行快速檢測時，很容易造成各類致病菌及組織樣品的污染，這類污染物具有一定的傳染性，倘若處理不當會不僅會造成檢驗室的污染，影響今后的檢測結果；更會對實驗人員的身體健康造成傷害。另外檢測中所用部分生物試劑也會對檢驗員造成潛在的危害，如若細胞裂解液、各類酶、溴化乙錠染色液以及各類模板及其所對應的引物和探針等具有一定的致癌性和毒性[13]。

2.1.2 易造成事故的儀器設備

食品檢測分子生物學實驗室中有很多專用檢驗設備，較為常見的有高壓滅菌鍋、干熱加熱器、均質器、液氮鋼瓶、高速冷凍離心機、PCR儀等設備[14]，具體操作時必須嚴格按照規定要求進行使用，否則會造成嚴重的后果。此外，某些大功率儀器設備使用時發生故障，有可能會引起電力故障甚至火災，尤其是高壓滅菌鍋，使用時輕則燙傷，重則爆炸；因此一定要注意防護。

為了確保日常檢測工作的順利開展我們一定要做到防患于未然，不僅需要注意熒光定量PCR等大型儀器的期間核查和校準，還需要注意實驗室安全維護。

3 食品檢測分子生物學實驗室的管理

3.1 分子實驗室的功能區域的設立及相應的衛生管理措施

根據各單位具體的檢測需要，食品檢測分子生物學科研實驗室可以劃分為RNA（DNA）提取專區、體系配置及核酸濃度檢查區、PCR擴增區、電泳區、滅菌區等區域。各區域之間通過傳遞窗傳遞物品，傳遞窗中安裝紫外燈，做好了隔離措施，從以確保降低實驗室污染、減少安全事故的發生。

此外在實驗室日常管理中，嚴格實行專人專責，注意日常檢測工作中儀器的期間核查、維護保養、水電安全、衛生消毒效果等的監測，對于大型儀器及危險系數較高的儀器，如高壓滅菌鍋，實時熒光定量PCR儀等使用前必須安排人員進行學習，考核合格后方可上崗，并定期做好檢驗人員的持續能力評價工作。

3.2 嚴格加強生物試劑的管理

食品檢測過程中所需使用的生物試劑的管理是每個檢測機構中分子生物實驗室管理的重要部分，特別是危險試劑的管理。因此必須從試劑的購買申請、采購、驗收、儲存、管理、使用、無害化處理等全過程加強規范管理[15]。對于劇毒試劑（如EB染料）、易燃（如酒精）、易爆品（如液氮等）以及試驗所需標準菌株的購買均得交單位審批后方可購買。在實驗室中，各類試劑及培養基均需做好嚴格的分類擺放，對于標準菌株的管理需嚴格實行雙人雙鎖管理制度，并要求填寫領用登記單，以及相關入庫表。

3.3 生物廢棄物管理

對于分子實驗過程中所產生廢棄物（如帽子、口罩、手套、槍頭、DNA提取物、擴增產物等），嚴格按照操作流程實行，絕不隨意放置，分子檢測實驗室應規定明顯的實驗廢棄物回收點，嚴禁把實驗廢棄物和普通生活垃圾混放，對于產生的廢棄物必須進行無害化處理后才能傾倒或填埋，及時做好污染物處理記錄，并且定期采用生物（化學）監測檢測滅菌及無害化處理效果。

4 未來展望

近幾年來，各地的分子生物學實驗室數量呈逐年增加的趨勢，而有關采用實時熒光定量PCR技術對食品進行快速檢測的地方標準也層不不窮，與此同時，隨著分子生物學技術更為廣泛的被應用，檢驗過程中的易制毒化學品的使用數量亦在不斷增加，因此迫切需要各單位對易制毒化學品進行規范管理，并在管理方式上進行創新；在提升檢測技術，優化檢測方法的同時，也要多借鑒他人的成功之處，在此基礎上，形成本單位更為有效的分子實驗室安全規范管理體系，使得檢測和管理每一個環節無懈可擊。通過單位各部門的充分合作，確保檢測工作更順利的開展 。

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