解毒消瘰方治療非霍奇金淋巴瘤的療效及對Th17/Treg細胞水平的影響

許曉娜，張宇，宋巖松，李航超，周郁鴻

非霍奇金淋巴瘤是起源于淋巴造血系統的惡性腫瘤，主要臨床表現以無痛性淋巴結腫大為主，根據臨床特點通常采取不同的治療策略，主要是大劑量化療聯合自體造血干細胞移植，但仍有部分患者原發耐藥或遠期復發[1]。筆者采用解毒消瘰方聯合化療治療非霍奇金淋巴瘤，取得了良好療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標準 納入標準：經病理活檢證實為惡性淋巴瘤的初治患者，按2008年WHO淋巴瘤診斷標準進行分類，按AnnArbor標準分期，按IPI評分系統評價危險度[2]，性別不限，年齡18～75歲，患者預計生存期≥3個月。排除標準：（1）合并嚴重心血管、肝、腎、造血系統及免疫系統疾病、精神病患者；（2）有嚴重不可控制的感染、出血等癥狀的患者；（3）妊娠或哺乳期婦女，對本試驗處方組成過敏者；（4）其他引起Th17/Treg細胞及相關細胞因子異常的疾病。

1.2 一般資料 選取2011年7月至2016年7月浙江中醫藥大學附屬第一醫院收治的患者60例，依據隨機數字表分為治療組及對照組，各30例。治療組男15例，女15例；年齡19～73歲，中位年齡42歲；病理分型：濾泡型5例，彌漫大B型21例，套細胞型3例，伯基特型1例；Ann Arbor分期：I期5例，II期10例，III期8例，IV期7例；按IPI評分：低危組8例，中低危組13例，中高危組5例，高危組4例。對照組男18例，女12例；年齡25～75歲，中位年齡43歲；病理分型：濾泡型4例，彌漫大B型23例，套細胞型胞型2例，伯基特型1例。Ann Arbor分期：I期6例，II期11例，III期7例，IV期6例。按IPI評分：低危組5例，中低危組10例，中高危組8例，高危組7例。兩組上述資料差異均無統計學意義（均P＞0.05），具有可比性。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 根據2016NCCN指南選擇不同病理類型非霍奇金淋巴瘤的化療方案，連續進行4個療程[2]。

1.3.2 治療組 在對照組基礎上聯合解毒消瘰方，方含：蛇六谷、紫菀、半枝蓮、藤梨根、桔梗、前胡、茯苓、白術、山海螺和蛇莓，每天1劑，早晚分服，3周為1個療程，連續服用4個療程。

1.3.3 支持治療 治療期間若中性粒細胞＜1.0×109/L，則給予粒細胞集落刺激因子（75g，惠爾血，日本麒麟鯤鵬）5～10g/kg皮下注射，每天1次，直至中性粒細胞＞1×109/L；治療期間有粒缺和/或發熱患者，預防性或根據藥敏試驗和經驗性給予抗生素治療；化療期間常規給予止吐處理。

1.3.4 隨癥加減 兼往來寒熱者，為肝膽有熱：加柴胡10g、炒梔子6g、丹皮10g；兼胸脅滿痛者，為氣郁重：加青皮10g、厚樸6g；兼倦怠乏力，為正氣虧虛：加炙黃芪15 g、生曬參6 g；兼潮熱盜汗，為陰虧：加麥冬12 g，沙參12 g。

1.4 檢測方法 （1）Treg細胞檢測：取2支流式試管，做好標記，分別取100l肝素鈉抗凝全血加入每支試管，然后依次加入20l同型對照（鼠IgG1/IgG2a）及抗CD4、CD25熒光單克隆抗體各10l，室溫避光保存20 min。取出試管，每管加入10倍稀釋了的1×紅細胞裂解液2ml，渦旋混勻，室溫避光10min。3000r/min離心5 min，棄上清。每管加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2ml，渦旋混勻，離心后棄去上清液，最后加入PBS液0.5ml混勻。4℃避光1h內上機檢測。使用流式細胞分析儀進行檢測，按規程操作。（2）Th17細胞檢測：采用常規密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞（PBMC），接種于培養板后加佛波酯（PMA）50g/L，離子霉素1mol/L，莫能霉素500g/L，在37℃、5%CO2溫箱中孵育培養6h。收集細胞并調整細胞濃度為1×107/ml。取2支試管，做好標記，對應每管加細胞懸液100l，隨后加入CD4-FITC10l，混勻后室溫下避光反應20min。取出試管，PBS洗滌2次，加入固定液100l室溫避光固定反應20min。離心棄上清液，PBS洗滌2次，加入破膜劑50l進行細胞打孔，室溫避光固定反應20min。離心棄上清液后測定管加入IL-17 A-PE 10l，對照管加入IgG1-PE 10l，室溫下避光反應20min，PBS洗滌2次后上流式細胞儀檢測。（3）血清TGF-1、IL-17檢測：取患者EDTA抗凝靜脈血5 ml，3000 r/min離心30 min取上清。用間接酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒檢測，操作流程以相應試劑盒說明書為準。

1.5 觀察指標

1.5.1 近期療效[3]完全緩解（CR），腫瘤消失并至少維持4周以上；部分緩解（PR），腫塊縮?。?0%，并維持4周以上；穩定（SD），腫塊縮?。?0%或增大＜25%，無新病灶出現；進展（PD），腫塊增大＞25%或有新病灶出現；總緩解率=CR+PR。

1.5.2 Th17/Treg細胞及相關細胞因子比較 治療組及對照組血清Treg、Th17細胞百分率，血清TGF-1、IL-17水平變化。

1.6 統計方法 應用SPSS16.0統計軟件進行處理。計數資料比較采用2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異統計學意義。

2 結果

2.1 近期療效 治療組與對照組總緩解率分別為86.67%和83.33%，兩組差異無統計學意義（2=0.131＞ 0.05），見表 1。

2.2 外周血Treg、Th17細胞百分率比較 治療組外周血Treg細胞百分率低于對照組，Th17細胞百分率高于對照組（均＜0.05），見表2。治療組血清TGF-1低于對照組，IL-17水平高于對照組（均＜ 0.05），見表 3。

3 討論

研究表明，誘發非霍奇金淋巴瘤的獨立危險因素是機體免疫缺陷及慢性炎性反應[4]。Th17和Treg細胞為初始CD+4T細胞分化的不同T細胞亞群，在機體免疫級聯反應及炎性反應中起十分重要作用[5]。Th17細胞存在明顯抗腫瘤作用[6]；而Treg細胞則以“主動”方式使機體免疫功能抑制[7]。全麗娜等[8]研究顯示，B細胞非霍奇金淋巴瘤患者淋巴結組織內Th17細胞比例顯著低于良性淋巴結。由此得出Treg細胞增加可能導致非霍奇金淋巴瘤患者機體免疫抑制，Th17細胞減少導致機體抗腫瘤機制減弱，從而易于腫瘤免疫逃逸。Th細胞分化的關鍵因子是TGF-1，其表達水平與Treg和Th17分化密切相關。Th17細胞分泌最具特征性細胞因子就是IL-17，它具有很強的促炎癥作用，內源性IL-17還可能對腫瘤免疫方面發揮保護性作用。解毒消瘰方可調節機體免疫功能，進而提高Th17及IL-17水平，抑制Treg細胞及TGF-1水平?，F代醫學對該病的治療措施主要包括放化療。雖然大部分患者能緩解或者得到治愈；但對于部分淋巴瘤患者療效仍不理想，出現復發耐藥，病情發展可致死亡。

表1 兩組近期療效比較 例

表2 兩組外周血Treg、Th17細胞百分率比較 %

表3 兩組血清TGF-1、IL-17水平比較 pg/ml

非霍奇金淋巴瘤以無痛性淋巴結腫大為主，祖國醫學并無非霍奇金淋巴瘤的記載，本病根據臨床癥狀歸屬中醫“瘰癘”、“石疽”、“瘤病”、“惡核”、“痰核”等范疇。中醫在調節免疫的同時能增加化療的效果并且減輕放化療的毒副作用[9]。研古通今，結合臨床經驗認為：此病本虛標實，發病的根本是正氣虧虛，正所謂“正氣不足而后邪氣踞之”。淋巴瘤發病的重要病因是“毒”，毒分內外，外感之“疫毒”、“溫毒”等稱之為外毒；陰陽平衡失司、五臟六腑功能紊亂而滋生出的“痰毒”、“瘀毒”、“火毒”等稱之為內毒。根據其病因病機及臨床表現自創了“解毒消瘰方”，方中蛇六谷化痰軟堅、散結解毒，聯合紫菀解“痰毒”；半枝蓮辛苦寒，可清熱解毒、消腫止痛，聯合藤梨根解外邪毒；桔梗行氣散瘀消積、散瘀解毒，聯合前胡、蛇莓解“瘀毒”；山海螺益氣養陰清內熱解“火毒”，茯苓、白術匡扶正氣，以扶正驅邪。全方解外感之邪毒，驅內在之痰瘀火毒，并扶住正氣，使正氣升邪毒乃去。有現代研究表明：紫菀、半枝蓮、山海螺、前胡有抑瘤及抗腫瘤活性；蛇六谷對部分癌細胞敏感并對白血病細胞有抑制作用。

本研究提示，非霍奇金淋巴瘤使用解毒消瘰方后在總緩解率方面差異無統計學意義（P＞0.05），這可能由于觀察時間相對較短，但中醫發揮調節免疫的時間較長有關。此研究數據表示治療組外周血Treg細胞百分率、血清TGF-1較對照組顯著降低，Th17細胞百分及IL-17水平顯著升高，表明非霍奇金淋巴瘤患者外周血Treg、Th17細胞比例及相關細胞因子表達水平異常，監測外周血Th17/Treg免疫平衡對NHL預后判定可能有重要意義。