膽堿能抗炎通路在病毒性心肌炎中的抗炎作用及其機制

陳學思，張麗梅，蔡敏敏

目前病毒性心肌炎的治療僅限于以對癥支持保守治療，并無有效的針對病因治療。雖大部分患者經適當治療可完全恢復，但少部分患者轉變為慢性心臟病，最終發展為非特異性擴張性心肌病[1-2]。最近研究發現，迷走神經及其遞質乙酰膽堿（ACh）所構成的膽堿能抗炎通路（CAP）對炎癥反應的調控具有重要的作用[3]。當機體受到損傷后，產生一系列炎癥反應，中樞接受到機體受到這種刺激信號后，將信息投射到迷走神經核團，激活傳出迷走神經纖維，使外周神經末梢釋放ACH，與免疫細胞7-nACh受體結合，通過細胞內信號轉導抑制促炎因子的釋放，調控炎癥反應[4-5]。這類炎癥因子包括IL-1、TNF-、IL-6 及 IL-17[6-7]；而對 IL-10、TGF-等抗炎因子沒有抑制作用[8]。然而CAP在病毒心肌炎中的作用尚不明確，本研究以CVB3感染BALB/C小鼠建立病毒性心肌炎模型，通過切斷右側迷走神經及煙堿等不同處理，觀察心肌炎癥浸潤程度、炎癥因子TNF-、INF、IL-1 、IL-6及相關通道蛋白STAT3和磷酸化STAT3表達變化，探討CAP在病毒性心肌炎中的作用及其機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物選擇和分組 健康雄性3周齡BALB/C小鼠200只，將BALB/C小鼠隨機分為5組：（1）正常對照組（n=40）：腹腔予注射不含病毒的病毒培養液；（2）假手術組（n=40）：分離右側迷走神經，腹腔予注射CVB3病毒；（3）煙堿組（n=40）：腹腔注射CVB3 病毒，后每天腹腔予注射煙堿；（4）迷走神經切斷+煙堿組：分離并切除右側迷走神經，腹腔予注射CVB3病毒，后每天腹腔予注射煙堿；（5）迷走神經切斷組（n=40）：分離并切除右側迷走神經，腹腔予注射CVB3病毒。

1.2 實驗動物模型建立 將各實驗處理組術前禁食8h，假手術組僅做迷走神經分離，迷走神經切斷組及迷走神經切斷+煙堿組迷走神經分離后予離斷，待小鼠飼養至4周齡后，正常對照組腹腔注射不含病毒的Eagel’s病毒培養液0.1ml，其余4組予腹腔注射100TCID 50/0.1 ml的CVB3稀釋液0.1 ml，接種當天記為第0天，從第1天開始煙堿組及迷走神經切斷組+煙堿組予煙堿腹腔注射處理（1.2 mg/kg，每天分3次注射），直至第14天末。

1.3 生存率 注射病毒當天為第0天，5組實驗組每組隨機選取20只小鼠進行一般情況及生存情況觀察研究，觀察各實驗組小鼠生存率。

1.4 標本留取 5組實驗組在接種第0天，分別取2只小鼠處死（留取ELISA用），第7和14天，分別取8只小鼠處死后，分離心臟備用。

1.5 病理組織學檢查 心臟組織固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后切片，再將切片進行HE染色后在電子顯微鏡下觀察心肌細胞排列及形態、心肌組織損傷、壞死、纖維化及炎性細胞浸潤程度，以心肌炎癥浸潤（I）及心肌壞死（N）進行評分。

1.6 Western blot檢測 5組心臟組織分別加入組織裂解液，冰上勻漿，超聲破碎，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取50g蛋白上樣，電泳、蛋白轉膜、抗體結合后，加ECL化學發光反應2min，采用AlhaimagerTM2200圖像分析系統進行處理，AlphaEase40軟件進行分析。

1.7 雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測 取5組心臟組織研磨成10%勻漿液體，超聲破碎細胞，4℃下3000 r/min

低速離心20min，取上清液，按說明書要求準備試劑后，對各組標本進行檢測，按照標準品OD值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線，根據標本OD值在標準曲線圖上查出相應待測炎癥因子的含量。

1.8 統計方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；計數資料以率表示，采用2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生存率 正常對照組小鼠第14天無死亡，生存率為100%；假手術組小鼠第14天的生存率為45%（18/40），煙堿組小鼠生存率為80%（32/40），迷走神經切斷+煙堿組小鼠生存率為70%（28/40），迷走神經切斷組小鼠生存率35%（14/40）。以注射病毒記為第0天，其死亡高峰在第6天到第10天，且煙堿組生存率高于假手術組（2=10.5，P＜0.05），迷走神經切斷+煙堿組生存率高于迷走神經切斷組（2=9.8，P＜ 0.05）。

2.2 心肌組織病理變化 光鏡下第7、14天，與假手術組相比，煙堿組及迷走神經切除+煙堿組的心肌組織炎癥浸潤及壞死減輕（t≥2.74，P＜0.05），而迷走神經切斷組的心肌組織炎癥浸潤及壞死加重（t≥14.20，P＜0.05）；與迷走神經切斷+煙堿組比較，迷走神經切除組心肌組織炎癥浸潤及壞死加重（t≥25.81，P＜0.05）。正常對照組心肌沒有病理變化。見表1。

2.3 WB檢測小鼠心肌信號蛋白表達水平

2.3.1 p-STAT3表達水平測定 在第7天，4組實驗處理組小鼠心肌較正常對照組p-STAT3表達均升高（t≥10.95，均P＜0.05），且煙堿組小鼠心肌表達低于假手術組（t=21.71，P＜0.05），迷走切斷+煙堿組及假手術組小鼠心肌表達均低于迷走切斷組（t≥21.34，均P＜0.05）；在第14天，5組實驗組小鼠心肌p-STAT3表達差異無統計學意義（t=1.64，P＞0.05）。見表2。

2.4 ELISA法檢測心肌炎癥因子 在第7天和第14天，與正常對照組比較，4組實驗處理組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均升高（t≥7.46，均P＜0.05）；與假手術組比較，煙堿組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均下降（t≥10.55，均P＜0.05），而迷走切斷組均升高（t≥10.69，均P＜0.05）；與迷走神經切斷組比較，迷走神經切斷+煙堿組TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子均下降（t≥11.72，均P＜0.05）。見表4。

表1 各組小鼠第7、14天心肌組織病理評分比較 分

表2 各組小鼠第7天、14天心肌組織p-STAT3表達水平

表3 各組小鼠第7天、14天心肌組織 7nAChR表達水平

3 討論

2000年，Borovikova等[7]通過人外周血巨噬細胞培養和動物模型實驗研究發現，刺激外周迷走神經或其遞質ACh能夠抑制炎癥性細胞釋放炎癥因子，減輕全身炎癥反應，并將其命名為“CAP”。Wang等[9]進一步研究發現，對敲除7亞基基因小鼠刺激迷走神經，這種炎癥抑制作用不會發生，確定了7煙堿型乙酰膽堿受體（7nAChR）在CAP中起關鍵作用。迷走神經不僅通過特有的中樞神經細胞7nAChR發揮抗炎作用，還用于巨噬細胞和CD4+T細胞等免疫細胞7nAChR[10-11]，信號遞質ACh作用于人巨噬細胞減少了TNF-、IL-1 、IL-6、IL-18等促炎因子的產生[12]。然而研究證實，煙堿作為7nAChR特異性激動劑，與ACh相比能更有效的抑制巨噬細胞促炎因子的產生[13]。7nAChR介導的抗炎作用通過影響核轉錄因子NF-kB，同時JAK2/STAT3通路也參與了其中[14]；已經充分證實激活CAP可以減輕炎癥反應，改善膿毒血癥、內毒素血癥、缺血再灌注損傷、失血性休克、胰腺炎、關節炎及其他炎癥反應綜合癥的預后。也有研究證實了用煙堿激活 CAP可以減輕自身免疫性心肌炎的炎癥，但是CAP在急性病毒性心肌炎中的作用研究尚不足。

表4 各組小鼠第7天、14天心肌組織炎癥因子表達水平 pg/ml

本研究通過煙堿和切斷右側迷走神經等不同處理，觀察病毒性心肌炎小鼠的生存率、心肌病理組織改變及心肌炎癥因子表達變化等來探討 CAP在病毒性心肌炎的作用。研究發現選擇7nAChR特異性激動劑煙堿激活CAP，可減輕心肌炎小鼠心肌的病理損傷和炎癥浸潤，提高小鼠的生存率。進一步研究發現，與假手術組比較，第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1 、IL-6炎癥因子表達均下調（均P＜0.05）。而切斷右側迷走神經拮抗CAP，加重了小鼠心肌病理損傷和炎癥浸潤，降低了小鼠的生存率；且在第7和14天，小鼠心肌的TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子表達均較假手術組上調（均P＜0.05）。同時與迷走神經切除組比較，切斷右側迷走神經+煙堿其心肌病理組織損傷及炎癥浸潤減輕，TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子的表達均下調（均P＜0.05）。因此筆者推測煙堿對病毒性心肌炎具有保護作用，其機制可能為煙堿作用與巨噬細胞7nAChR抑制TNF-、INF、IL-1及IL-6炎癥因子表達；迷走神經參與了膽堿能抗炎的作用通路，切斷右側迷走神經 CAP的保護作用減弱。與正常對照組比較，假手術組、煙堿組、迷走神經切斷＋煙堿組、迷走神經切斷組STAT3的磷酸化水平升高（P＜0.05），提示JAK/STAT3通路STAT3磷酸化參與了炎癥反應；在第7天，與假手術組比較，煙堿組STAT3磷酸化水平降低，而迷走神經切斷組STAT3磷酸化水平增高。因此筆者推斷煙堿激動7nAChR可能通過抑制JAK2/STAT3通路STAT3磷酸化參與炎癥保護作用。