miRNA-335- 5 p、CEA在結(jié)腸癌患者血清中的表達水平及與腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

江愛宗，李榮年，姜艷輝，謝志超，王冰

遼河油田總醫(yī)院普外科，遼寧 盤錦124010

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，多發(fā)生于乙狀結(jié)腸與直腸交界處[1]。臨床治療結(jié)腸癌主要以手術(shù)切除為主，放化療結(jié)合為輔。腹腔鏡手術(shù)是近幾年出現(xiàn)的治療結(jié)直腸癌的新技術(shù)，可以有效提高手術(shù)效率，但腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導致結(jié)腸癌患者治療失敗和死亡的重要原因，嚴重威脅著人類的生命健康和安全[2]。相關(guān)研究表明，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CAE）與結(jié)腸癌患者的臨床特征密切相關(guān)，是評估患者預(yù)后及判斷療效的常用生物標志物[3]。Kou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，多種微小RNA（microRNA，miRNA）在結(jié)腸癌組織中存在差異表達，參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。但CAE和miRNA-335-5p能否作為有效的生物標志物應(yīng)用于結(jié)腸癌的臨床治療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測目前尚不清楚。本研究通過檢測結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335-5p、CEA的表達水平，探討其與結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在為將miRNA-335-5p、CEA應(yīng)用于臨床監(jiān)測結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年10月至2015年1月遼河油田總醫(yī)院收治的行腹腔鏡根治手術(shù)的結(jié)腸癌患者為結(jié)腸癌組。納入標準：①均經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診為結(jié)腸癌且均為首次確診；②結(jié)腸單部位病變，無遠處轉(zhuǎn)移；③術(shù)前未接受放化療；④臨床及隨訪資料完整。排除標準：①非首次確診的結(jié)腸癌患者；②有結(jié)腸多部位病變及腸息肉、結(jié)腸炎等疾病者；③合并其他惡性腫瘤者；④有自身免疫性疾病者。根據(jù)納入和排除標準，結(jié)腸癌組共納入患者96例。另外，選取同期于本院行體檢的健康體檢者30例為對照組。其中結(jié)腸癌組男49例，女47例；平均年齡（59.87±8.52）歲。對照組男16例，女14例；平均年齡（60.17±9.10）歲。兩組的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

Trizol試劑購自日本Takara公司，MystiCq?microRNA qPCR Assay Primer購自美國Sigma公司，AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Anti-Carcino Embryonic Antigen CEA購自英國Abcam公司，酶聯(lián)免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）CEA試劑盒購自鄭州博賽生物技術(shù)研究所，實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物由上海生工生物公司合成；qRT-PCR儀、MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 血清標本采集分別于手術(shù)當日和體檢當日采集結(jié)腸癌患者和健康對照者的空腹靜脈血5 ml，采用抗凝管保存，離心后收集上清，于-20℃保存待測。

1.3.2 qRT-PCR法檢測miRNA-335- 5 p水平采用qRT-PCR檢測血清miRNA-335-5p水平。Trizol法提取血清總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀（Bio-Rad）對miRNA-335-5p進行擴增（表1）。反應(yīng)體系：10μmol/L引物各 0.4μl，SYBR?Green Mix 5μl，50 ng/μl cDNA 1μl，ddH2O 3.2μl，共10μl。反應(yīng)條件：95℃ 90 s；95℃30 s，62℃30 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，采用相對定量法，用 2-ΔΔCt計算 miRNA-335-5p的表達水平。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3.3 ELISA法檢測血清CEA蛋白表達水平采用ELISA法檢測結(jié)腸癌組和對照組的血清CEA蛋白表達水平，具體操作嚴格按照ELISA試劑盒說明進行。

1.3.4 評判標準正常情況下，CEA濃度為0～5 ng/ml，因此本研究以CEA≤5 ng/ml為低表達，CEA＞5 ng/ml為高表達。以miRNA-335-5p/U6=1為標準，miRNA-335-5p/U6＜1判定為miRNA-335-5p低表達；≥1判定為miRNA-335-5p高表達。

1.3.5 隨訪腹腔鏡術(shù)后1個月，采用門診復(fù)查的方式對所有結(jié)腸癌患者進行為期2年的隨訪，隨訪日期截至2017年1月31日。隨訪期間，每6個月進行1次腸鏡、腹部CT或B超、胸部X射線檢查，以評估患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。隨訪均以不影響患者生活及治療為前提。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)-計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman秩檢驗分析結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335-5p與CEA表達的相關(guān)性；采用COX回歸模型分析影響結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。采用GraphPad Prism分析miRNA-335-5p、CEA不同表達水平結(jié)腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，Log-rank法比較miRNA-335-5p、CEA不同表達水平結(jié)腸癌患者的術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-335- 5 p、CEA表達情況的比較

96例結(jié)腸癌患者中，77例患者的血清miRNA-335-5p呈低表達，低表達率為80.2%（77/96）；71例患者的血清CEA呈高表達，高表達率為74.0%（71/96）。結(jié)腸癌組患者的血清miRNA-335-5p表達水平明顯低于對照組，血清CEA表達水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 對照組和結(jié)腸癌組血清miRNA-335- 5 p、CEA表達水平的比較（±s）

表2 對照組和結(jié)腸癌組血清miRNA-335- 5 p、CEA表達水平的比較（±s）

組別對照組（n=30）結(jié)腸癌組（n=96）t值P值miRNA-335-5p/U6 2.39±0.61 0.79±0.16 23.425 0.000 CEA（ng/ml）3.89±0.71 6.79±1.16 12.936 0.000

2.2 血清miRNA-335- 5 p、CEA表達與結(jié)腸癌患者臨床特征的關(guān)系

血清miRNA-335-5p表達與結(jié)腸癌患者的AJCC分期、組織分化程度有關(guān)（χ2=12.71、8.90，P＜0.05）；血清CEA表達與結(jié)腸癌患者的AJCC分期、組織分化程度有關(guān)（χ2=16.64、21.73，P＜0.05）；血清miRNA-335-5p、CEA表達均與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、陽性淋巴結(jié)數(shù)目無關(guān)（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征結(jié)腸癌患者血清miRNA-335- 5 p、CEA的表達情況（ n=96）

2.3 結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335- 5 p、CEA表達的相關(guān)性分析

Spearman秩檢驗分析結(jié)果顯示：結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335-5p與CEA的表達呈負相關(guān)（r=-0.602，P＜0.05）。

2.4 不同血清miRNA-335- 5 p、CEA表達水平結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的比較

miRNA-335-5p低表達結(jié)腸癌患者的術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為35.06%，高于miRNA-335-5p高表達患者的5.26%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.818，P＜0.05）；CEA高表達結(jié)腸癌患者的術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為36.62%，明顯高于CEA低表達患者的8.00%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.977，P＜0.01）。（圖1、圖2）

圖1 miRNA-335- 5 p低表達（ n=77）和高表達（ n=19）結(jié)腸癌患者的術(shù)后 2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率

圖2 CEA低表達（ n=25）和高表達（ n=71）結(jié)腸癌患者的術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率

2.5 結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示：AJCC分期、組織分化程度、miRNA-335-5p表達、CEA表達與結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.01）。多因素分析結(jié)果顯示：AJCC分期、組織分化程度、miRNA-335-5p表達、CEA表達是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素（P＜0.01）。（表4）

表4 結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素分析（ n=96）

3 討論

結(jié)腸癌具有高復(fù)發(fā)率、高病死率等特點，其發(fā)生與少纖維、多脂肪的飲食習慣密切相關(guān)[5]。隨著人口老齡化，飲食結(jié)構(gòu)及飲食習慣的改變，中國結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均逐年上升。近年來，結(jié)腸癌的診斷和治療方法已取得很大進步，但結(jié)腸癌患者的病死率仍然很高，其中術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的主要因素。因此，尋找有效生物指標以監(jiān)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移成為臨床上亟需解決的問題。

miRNA含有18～25個核苷酸，是真核生物細胞內(nèi)一類高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能與靶基因mRNA 3′-非編碼區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達，在細胞增殖、分化及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[6]。許多研究已證實，miRNA具有抑癌或致癌功能，可作為生物標志物或結(jié)腸癌的治療靶點應(yīng)用于臨床治療。Tanaka等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b-1、miRNA-378a可以預(yù)測疫苗治療結(jié)直腸癌的效果。Masuda等[8]經(jīng)過大量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-18a、miRNA-19b、miRNA-29a、miRNA-17-3p、miRNA-133a等miRNA在結(jié)腸癌患者血清中表達上調(diào)；miRNA-375、miRNA-93、miRNA-181-b、miRNA-24、miRNA-320a等miRNA在結(jié)腸癌患者血清中表達下調(diào)。

miRNA-335-5p是哺乳動物常見的miRNA之一，存在于多種細胞和組織中。相關(guān)研究表明，miRNA-335-5p在腎細胞癌[9]、肺癌[10]、胃癌[11]等多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。Sun等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-335-5p在結(jié)腸癌組織中低表達，具有抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組患者的血清miRNA-335-5p表達水平較對照組明顯降低，與Sun等[12]研究結(jié)果一致。提示miRNA-335-5p在結(jié)腸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。本研究中，血清miRNA-335-5p表達與結(jié)腸癌患者的AJCC分期、組織分化程度有關(guān)，但與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、陽性淋巴結(jié)數(shù)目無關(guān)，提示miRNA-335-5p參與結(jié)腸癌的病理分化。本研究對影響結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miRNA-335-5p低表達患者的2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高于miRNA-335-5p高表達患者（P＜0.05），是影響結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素之一。提示miRNA-335-5p低表達與結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測miRNA-335-5p可作為診斷結(jié)腸癌及監(jiān)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要靶點。

CEA是被廣泛認可的腫瘤標志物之一，在胃癌[13]、結(jié)腸癌[14]等惡性腫瘤中高表達，已應(yīng)用于常規(guī)檢查，是多種消化道惡性腫瘤術(shù)前診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測的生物標志物。Polat等[15]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者血清CEA濃度顯著高于對照組，與患者的分化程度、臨床分期和腫瘤轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CEA在結(jié)腸癌患者血清中高表達，AJCC分期為Ⅲ～Ⅳ期，組織分化程度為中高分化的結(jié)腸癌患者血清中CEA表達水平較高。提示CEA表達與結(jié)腸癌患者的AJCC分期和組織分化程度密切相關(guān)，可能參與了腫瘤組織分化過程，與Polat等[15]報道一致。Sugarbaker等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CEA可以作為監(jiān)測放射治療結(jié)直腸癌療效的生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，CEA高表達患者的術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯高于CEA低表達患者，是影響結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素之一。提示CEA高表達與結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測CEA可作為診斷結(jié)腸癌及監(jiān)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效生物標志物。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335-5p呈低表達，CEA呈高表達，兩者與結(jié)腸癌患者的AJCC分期、組織分化程度及術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率有關(guān)。結(jié)腸癌患者血清中miRNA-335-5p與CEA的表達呈負相關(guān)，推測兩者可能通過某種機制共同參與調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，有待后續(xù)進一步研究中進行探究證實。