上調(diào)微小RNA-200 a表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感度的影響及其機(jī)制

王亞飛，宋小天，宋長(zhǎng)亮，張磊，萬(wàn)良剛，杜雪菲

1邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤科，河北 邯鄲056000

2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，河北 邯鄲056000

3冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院骨科，河北 邯鄲056000

在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，其中，病死率位居惡性腫瘤的首位。根據(jù)組織學(xué)特征和臨床特點(diǎn)，肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，后者占肺癌的85%以上[1]。早期肺癌患者多無(wú)自覺(jué)癥狀，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬于晚期，錯(cuò)失了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，故放療和化療是肺癌的主要治療手段。術(shù)后放化療能夠有效減少肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但部分患者常常在一線治療后對(duì)化療藥物表現(xiàn)出較低的化療敏感度，如何增強(qiáng)化療藥物的敏感度是化療面臨的重要難題。化療是利用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，達(dá)到治療腫瘤的目的。紫杉醇是從紅豆杉科植物中提取的一種抗腫瘤二萜類化合物，是一種細(xì)胞周期特異性藥物，在乳腺癌和肺癌等多種腫瘤的化療中得到廣泛應(yīng)用，但患者常常出現(xiàn)抗藥性和耐藥性。如何實(shí)現(xiàn)紫杉醇在治療過(guò)程中增敏、增效的作用是臨床亟需解決的問(wèn)題。微小RNA（miroRNA，miRNA）是一類具有組織特異性、高度保守性和時(shí)序性等特征的小分子非編碼小RNA，在腫瘤基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程中具有重要的作用。miRNA-200家族是miRNA的重要組成部分，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。miRNA-200a作為miRNA-200家族中的重要一員，參與肝癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等過(guò)程[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200a在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等[5-7]。但目前未見(jiàn)關(guān)于miRNA-200a是否參與肺癌治療過(guò)程中紫杉醇耐藥機(jī)制的相關(guān)研究，本研究以體外實(shí)驗(yàn)的方式采用脂質(zhì)體法干擾miRNA-200a在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞紫杉醇化療敏感性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥性提供新的方向和理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人肺上皮16HBE細(xì)胞株和人肺癌A549細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，miRNA-200a模擬物（miRNA-200a mimics）、miRNA-200a陰性對(duì)照（mimics NC）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物均購(gòu)自上海吉瑪公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒和熒光定量PCR儀均購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、LipofectamineTM2000和電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，紫杉醇（純度99.5%）購(gòu)自西安天豐生物科技有限公司，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）檢測(cè)分析試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和Trizol試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG-HRP二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，酶標(biāo)儀和凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將復(fù)蘇后的正常人肺上皮16HBE細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基上，置于5%CO2、95%濕度和37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔1天換液1次，待細(xì)胞幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶時(shí)，以0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)采用qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常人肺上皮16HBE細(xì)胞和A549細(xì)胞，采用Trizol法提取兩種細(xì)胞中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的總RNA濃度及純度。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)miRNA-200a特異性引物、內(nèi)參U6引物及相應(yīng)的組分配成20 μl的反應(yīng)體系（Master mix10 μl、上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl，ddH2O 6.4 μl），以95℃ 5 min（1個(gè)循環(huán)）、95℃ 30 s（35個(gè)循環(huán)）、58℃ 30 s（35個(gè)循環(huán)）、72℃ 2 min（35個(gè)循環(huán)）和72℃6 min（1個(gè)循環(huán)）的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將其分為空白對(duì)照組、mimics NC組和miRNA-200a mimics組，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書的實(shí)驗(yàn)步驟將miRNA-200a模擬物和轉(zhuǎn)染試劑混合物轉(zhuǎn)至miRNA-200a mimics組細(xì)胞中，miRNA-200a陰性對(duì)照和轉(zhuǎn)染試劑混合物轉(zhuǎn)至mimics NC組細(xì)胞中，空白對(duì)照組中只加入轉(zhuǎn)染試劑。其中，miRNA-200a模擬物和miRNA-200a陰性對(duì)照的濃度均為25 μmol/L。轉(zhuǎn)染48 h后，按照1.2.2中的步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 MTT法檢測(cè)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/ml，以每孔1 ml接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。將其隨機(jī)分為紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組。其中，miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞先以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miRNA-200a模擬物，紫杉醇組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，兩組細(xì)胞分別加入終濃度為2、4、8、16、32 nmol/L的紫杉醇溶液，處理反應(yīng)24 h后，加入濃度為5 g/L的MTT溶液10 μl，避光孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入DMSO溶解結(jié)晶物后，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)兩組細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算兩組細(xì)胞相應(yīng)濃度的細(xì)胞增殖抑制率，并計(jì)算出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。其中，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液后，以105/ml細(xì)胞接種至96孔板上，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、miRNA-200a mimics組、紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組。按照1.2.3中的實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)染miRNA-200a模擬物至miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞，空白對(duì)照組和紫杉醇組細(xì)胞不進(jìn)行處理，4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以8 nmol/L的紫杉醇處理紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞，處理24 h后，收集各組細(xì)胞，以RIPA提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其純度及濃度。取變性后的50 μg樣品蛋白，注入SDSPAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上后，置于5%的脫脂奶粉封閉液中處理1 h，加入稀釋濃度為1∶1000的β-catenin抗體和GAPDH抗體，4℃下孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入稀釋濃度為1∶2000的IgG-HRP二抗，于37℃下孵育2 h，以ECL顯色。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-200 a在非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量為（0.26±0.08），明顯低于正常人肺上皮16HBE細(xì)胞的（1.02±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.407，P＜0.01）。

2.2 轉(zhuǎn)染后 A549細(xì)胞中miRNA-200 a的相對(duì)表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后，空白對(duì)照組、mimics NC組、miRNA-200a mimics組細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.06±0.12）、（1.18±0.25）和（5.02±0.16），3組細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=445.487，P＜0.01）。mimics NC組細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.795，P＞0.05）；miRNA-200a mimics組細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.239，P＜0.01）。miRNA-200a mimics組細(xì)胞中miRNA-200a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于mimics NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.408，P＜0.01）。

2.3 miRNA-200 a對(duì)紫杉醇化療藥物敏感度的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著紫杉醇濃度的增加，A549細(xì)胞受到的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，且呈一定的濃度依賴性；與紫杉醇組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-200a mimics后，隨著紫杉醇濃度的增加，A549細(xì)胞受到的增殖抑制作用增強(qiáng)（t=4.279、5.968、4.107、3.801、2.825，P＜ 0.05）。miRNA-200a+紫杉醇組的IC50為5.90 nmol/L，紫杉醇組的IC50為 9.57 nmol/L。（表1）

表1 不同濃度紫杉醇溶液處理后 A549細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度紫杉醇溶液處理后 A549細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：*與紫杉醇組比較，P＜0.05

組別紫杉醇組miRNA-200a+紫杉醇組紫杉醇濃度（nmol/L）2 18.2±1.4 25.7±2.6*48 23.1±3.0 37.3±2.8*43.8±5.2 58.7±3.5*16 62.4±3.8 75.8±4.9*32 71.2±5.1 84.7±6.2*

2.4 轉(zhuǎn)染聯(lián)合紫杉醇對(duì)Wnt/ β-catenin信號(hào)通路相關(guān)的 β-catenin蛋白的影響

空白對(duì)照組、紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別（0.78±0.03）、（0.62±0.05）、（0.48±0.05）和（0.25±0.04），4組細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.12，P＜0.01）。與空白對(duì)照組相比，紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（t=4.526、8.485、14.991，P＜0.01）；與紫杉醇組相比，miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.465，P＜0.01）。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)染聯(lián)合紫杉醇處理后 A549細(xì)胞β -catenin蛋白的表達(dá)情況

3 討論

miRNA-200家族通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中扮演著重要的角色。miRNA-200a是miRNA-200家族的重要成員，在多種腫瘤組織中表達(dá)水平較低，以抑癌基因的角色參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生理過(guò)程[8]。有研究表明，miRNA-200a還參與多種腫瘤化療藥物的耐藥過(guò)程，如Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miRNA-200a可能通過(guò)調(diào)控與耐藥相關(guān)的ABC家族基因的表達(dá)，增加卵巢腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感度；沈阿靈等[10]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-200a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)大腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性。目前，關(guān)于miRNA-200a對(duì)非小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感度的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體法上調(diào)肺癌A549細(xì)胞中miRNA-200a的表達(dá)后，加入紫杉醇藥物進(jìn)行處理，采用MTT法檢測(cè)miRNA-200a對(duì)紫杉醇處理的A549細(xì)胞的增殖抑制情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞的IC50為5.90 nmol/L，紫杉醇組的IC50為9.57 nmol/L，表明上調(diào)miRNA-200a表達(dá)能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療藥物的敏感度。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt通路，是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要途徑。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程密切相關(guān)[11-13]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控的核心因子，是Wnt/βcatenin通路激活的重要標(biāo)志。有研究表明，紫杉醇可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，如Fu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌對(duì)化療藥物紫杉醇的治療可產(chǎn)生耐藥性，這種耐藥性與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，在人卵巢癌細(xì)胞株A2780和SKOV3中，紫杉醇能夠誘導(dǎo)β-catenin表達(dá)；涂雪松等[15]研究指出紫杉醇可能通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1的增殖，并促進(jìn)其凋亡。侯峰強(qiáng)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇通過(guò)抑制膽管癌QBC939細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)，阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路中βcatenin蛋白的表達(dá)還受miRNA-200a的調(diào)控。Su等[17]指出，miRNA-200a通過(guò)與β-catenin相互作用，可阻斷胃癌SGC790細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。為了進(jìn)一步探討過(guò)表達(dá)miRNA-200a能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療藥物敏感度的作用機(jī)制，本研究上調(diào)肺癌A549細(xì)胞中miRNA-200a的表達(dá)后，加入紫杉醇藥物進(jìn)行處理，并采用Western blot檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞中βcatenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有所降低，并且miRNA-200a+紫杉醇組細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于紫杉醇組（P＜0.01）。結(jié)果提示，上調(diào)miRNA-200a表達(dá)可通過(guò)阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療藥物的敏感度。

總之，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)miRNA-200a表達(dá)能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療藥物的敏感度，其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，也提示miRNA-200a可能是提高紫杉醇放療敏感度的潛在靶點(diǎn)，為治療非小細(xì)胞肺癌提供了新的線索。