microRNA-200 a在惡性肝臟腫瘤患者血液及腫瘤組織中的表達及其與預后的關系

王勇，代榮陽

1西南醫科大學基礎醫學院，四川 瀘州646000

2自貢市第三人民醫院檢驗科，四川 自貢643020

肝癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一，中國肝癌的發病率和病死率均居世界前列[1]。該病好發于40歲以上男性，進展緩慢，患者早期易忽視，其典型癥狀為肝區增大脹痛、消瘦，后續易引發電解質紊亂、重要器官轉移以及惡病質衰竭狀態等，重者可危及生命[2-3]。microRNA是一種非參與編碼的小RNA，可調控機體細胞的分化以及增殖，故其水平與腫瘤的發生及發展密切相關[4-5]。microRNA-200a作為microRNA家族的重要成員之一，可調控腫瘤細胞的基因轉錄后翻譯過程[6]。既往研究顯示，其在多種腫瘤細胞中的表達呈下調狀態[7-8]；同樣，有文獻顯示，其在多種惡性腫瘤患者血液中的表達亦呈下調狀態[9]。而目前對血液和腫瘤組織中microRNA-200a表達與惡性肝臟腫瘤患者預后關系方面的深入研究較少，其在預測惡性肝臟腫瘤患者預后方面的價值尚未得到充分認證。因此，本研究旨在觀察microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤患者腫瘤組織和血液中的表達，探討其在預測惡性肝臟腫瘤方面的臨床意義，為microRNA-200a廣泛應用于惡性肝臟腫瘤患者篩查提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2009年1月至2011年1月就診于自貢市第三人民醫院肝膽外科并行肝癌完整切除術的惡性肝臟腫瘤患者的病歷資料。納入標準：①患者肝臟腫瘤為原發性且無轉移；②術前患者肝功能Child-Pugh分級為A～B級，保肝治療評為A級后接受手術；③經影像學診斷腫瘤無遠處轉移；④患者接受肝癌根治術，肝臟切除量均在70%內，術后標本均被確診為肝細胞癌。排除標準：①術后合并重度感染；②合并急性心衰、心源性休克及其他重要臟器疾病。共納入79例患者作為肝癌組，其中男58例，女21例；年齡41～70歲，平均年齡（55.14±8.68）歲，收集其肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織及血液樣本。癌旁組織取自距離肝癌組織2 cm組織，正常肝臟組織取自距離肝癌組織3～5 cm組織。另外，選擇無肝膽原發疾病或影響肝功能的其他疾病且無腫瘤的83例患者為對照組，其中男性49例，女性34例；年齡39～73歲，平均（52.74±10.62）歲。兩組患者年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑RNA提取試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，反轉錄試劑盒購自保齡寶生物股份有限公司，實時PCR試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2.2 肝臟腫瘤患者血樣采集及組織microRNA提取 所有患者入院后晨起空腹抽取靜脈血8 ml，于4℃5000×g條件下離心15 min，-100℃條件下保存血清。利用試劑盒提取總microRNA，并保存于-100℃條件下待檢。分別收集肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織總體microRNA，并將A260/A280比值控制在1.8～2.1。

1.2.3 microRNA反轉錄 取反轉錄體系20 μl，并于37℃條件下反應1 h，95℃條件下反應5 min，而后將體系于-20℃條件下保存。

1.2.4 PCR擴增與定量 取擴增體系25 μl，于95℃預變性15 min后，94℃、15 s，55℃、30 s，70℃、30 s條件下擴增40個循環。所有待檢測樣本均設3個復孔，利用公式△△Ct=試驗組（Ct樣本-Ct對照）-對照組（Ct樣本-Ct對照），得出microRNA-200a在肝癌細胞及肝癌組織和癌旁組織中的表達量，而后對惡性肝臟腫瘤患者血清、腫瘤組織及癌旁組織中的microRNA-200a相對表達量進行分析。

1.3 評價標準

比較惡性肝臟腫瘤患者與對照組血液標本中microRNA-200a相對表達量；同時分析肝癌患者體內肝癌組織和癌旁組織中microRNA-200a相對表達量。

1.4 腫瘤患者術后處理及隨訪

肝臟腫瘤患者術后均給予胃腸減壓、腹腔引流。術后給予靜脈滴注白蛋白20 g，3～5天。密切監測患者血常規、肝腎功能等情況。術后5天根據B超情況拔除腹腔引流管，其他均對癥處理。

對參與研究的79例腫瘤患者進行為期5年的隨訪，首次隨訪時間為治療結束3個月后，之后每隔3個月門診復查或電話隨訪一次。終點事件：患者自入選時間起于隨訪期間因惡性肝臟腫瘤及并發癥導致死亡。原始資料參照患者入院記錄，并將末次隨訪記錄作為隨訪結果，記錄患者發病年齡、性別、肝炎及肝硬化病史、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平、腫瘤大小、分化程度、是否轉移及TNM分期等。刪失定義為患者失訪、拒絕訪問、中途退出、死于其他與研究無關的原因。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例數表示，兩組比較采用χ2檢驗；繪制ROC曲線，通過約登指數確定診斷切點；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清microRNA-200 a相對表達量的比較

肝癌組患者血清microRNA-200a相對表達量為（4.61±1.28），明顯低于對照組的（6.20±0.78），差異有統計學意義（t=9.599，P=0.000）。

2.2 肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織microR-NA-200 a相對表達量的比較

惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織的microRNA-200a相對表達量分別為（0.67±0.18）、（1.68±0.27）、（2.88±0.36），組間比較，差異有統計學意義（F=17.242，P=0.000）。

2.3 不同臨床特征肝癌患者腫瘤組織及血清中microRNA-200 a相對表達量的比較

高中分化及未發生轉移的惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達量均明顯高于低分化及發生轉移的患者，差異均有統計學意義（t=4.882、6.245，P＜0.01）；不同性別、年齡、肝炎或肝硬化病史、AFP水平、腫瘤直徑及TNM分期患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。AFP水平≤8.1 ng/L、高中分化、未發生轉移及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達量均明顯高于AFP水平＞8.1 ng/L、低分化、發生轉移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者，差異均有統計學意義（t=7.097、5.481、4.899、3.317，P＜0.01）；不同年齡、性別、肝炎或肝硬化病史、腫瘤直徑患者血清中microRNA-200a相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.4 microRNA-200 a相對表達量與患者預后的關系

對79例肝癌患者進行隨訪，共失訪5例，死亡31例，死亡率為41.9%。根據患者結局情況分為死亡組和生存組。死亡組患者肝癌組織microRNA-200a相對表達量為（0.58±0.17），明顯低于生存組的（0.72±0.14），差異有統計學意義（t=3.878，P=0.000）。根據兩組患者肝癌組織microRNA-200a相對表達量構建預測患者結局的ROC曲線，得到AUC=0.824，最佳診斷切點為0.625，此時敏感度為0.791，特異度為0.645（圖1）。根據約登指數確定的切點0.625，將肝癌患者分為高表達組和低表達組。其中，高表達組48例，失訪3例，死亡11例；低表達組31例，失訪2例，死亡20例。經Log-rank檢驗，高表達組患者生存情況明顯優于低表達組，差異有統計學意義（χ2=15.090，P=0.000）（圖 2）。

表1 不同臨床特征肝癌患者腫瘤組織及血清中microRNA-200 a的相對表達量（ n=79）

圖1 肝癌組織microRNA-200 a相對表達量預測肝癌患者（ n=79）結局的ROC曲線

圖2 microRNA-200 a高表達（ n=48）與低表達（ n=31）肝癌患者的生存曲線

3 討論

肝癌作為常見的消化系統惡性腫瘤，好發于中年男性，發病后除肝區增大脹痛、消瘦等臨床經典表現外[10]，亦可引發惡病質衰竭狀態等[11]，甚至威脅患者的生命[12]。有文獻表示，microRNA在調控機體細胞的分化、增殖方面作用明顯，故其水平與腫瘤的發生發展密切相關[13-14]。microRNA-200a作為microRNA家族的重要成員之一，既往文獻提示，其在多種惡性腫瘤患者組織及血清中的表達均呈下調狀態，而目前對血清和腫瘤組織中microRNA-200a表達與惡性肝臟腫瘤患者預后方面的深入研究較少，為提高惡性肝臟腫瘤切除率，降低其風險，延長患者預期壽命并提高生存質量，對于microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤患者腫瘤組織和血液中表達的研究已然成為現階段臨床工作的重點和熱點之一[15]。本研究回顧性分析了79例行肝臟腫瘤切除術患者的病歷資料，并分別收集其肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織及血液樣本，并選取另外排除肝膽疾病的83例患者作為對照組，比較兩組患者血清microRNA-200a相對表達量，結果顯示，惡性肝臟腫瘤患者microRNA-200a相對表達量明顯低于對照組，這一結果提示microRNA-200a可能具有抑制腫瘤生長的作用，但仍需進一步研究。

進一步比較惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織microRNA-200a相對表達量發現，正常肝臟組織microRNA-200a相對表達量高于癌旁組織，而癌旁組織microRNA-200a相對表達量高于肝癌組織。也有研究分析microRNA-200a下調在肝癌組織中較正常組織明顯[16]，本研究與報道結果基本一致。

進一步比較患者臨床特征與肝癌組織及血清中microRNA-200a相對表達量關系結果提示：高中分化及未發生轉移的惡性肝臟腫瘤患者肝癌組織中microRNA-200a相對表達量均明顯高于低分化及發生轉移的患者，AFP水平≤8.1 ng/L、高中分化、未發生轉移及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達量均明顯高于AFP水平＞8.1 ng/L、低分化、發生轉移及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的患者。這一結果進一步提示了microRNA-200a可能具有抑制肝臟惡性腫瘤生長的作用。不同TNM分期及AFP水平的患者microRNA-200a相對表達量在血清中存在差異，而在腫瘤組織中差異不顯著，這可能與microRNA-200a不僅在腫瘤中表達有關[17]。

比較肝癌死亡組與生存組的microRNA-200a相對表達量，可見生存組的相對表達量明顯高于死亡組，根據ROC曲線確定的診斷切點將患者分為microRNA-200a高表達組和低表達組，經Log-rank檢驗發現，microRNA-200a高表達組生存情況明顯優于microRNA-200a低表達組，更加證明了microRNA-200a表達與肝癌患者預后的關系，但對于microRNA-200a與患者預后相關性的作用機制目前仍未確定。

同時，本研究尚存在不足，研究對象較少，納入臨床特征種類較少。本研究僅能證明microRNA-200a與肝癌患者預后存在一定的關系，但對于兩者因果關系的判斷還需要進一步證明。

通過本研究證明，惡性肝臟腫瘤患者血清中microRNA-200a相對表達量明顯低于對照組正常患者；microRNA-200a在惡性肝臟腫瘤組織相對表達量較癌旁組織、正常肝臟組織明顯減低；microRNA-200a表達與肝癌患者預后有關，并且microRNA-200a表達水平越高，患者預后越好。