PCDH 8基因甲基化在食管癌診斷中的價值及其與患者臨床特征的關系△

張晉，張丹杰#，李少民，靳耀峰，王原

西安交通大學第二附屬醫院1胸外科，2病理科，西安710048

3陜西省人民醫院病理科，西安710068

食管癌（esophageal carcinoma，EC）屬于十分常見的消化系統惡性腫瘤之一，多發生于食管上皮，發病隱匿，患者早期無典型的臨床癥狀，因此，80%以上的EC患者確診時已經進展至晚期階段，從而嚴重影響了患者的預后[1]。目前，關于食管鱗癌的發病機制尚不明確，且患者的早期癥狀不典型，從而為臨床診斷和治療帶來較大的困難[2]。與其他惡性腫瘤發生、發展的病理過程一樣，EC的進展也是一個涉及多因素、多基因突變的復雜過程。有研究顯示，EC組織分子水平的改變早于臨床表現的出現，因此，早期診斷和干預對逆轉食管鱗狀上皮低級別上皮內瘤變、降低EC的發病率十分重要[3]。其中，抑癌基因甲基化屬于表觀遺傳學的范疇，與腫瘤的發生、發展密切相關，是近幾年的研究熱點[4]。PCDH8基因屬于非聚集性原鈣黏蛋白（protocadherin，PCDH）基因家族的成員之一，在很多腫瘤組織中的表達水平較低，且啟動子發生甲基化，被認為是一種候補抑癌基因[5]。目前，關于PCDH8基因在EC組織中的表達情況尚無確切的研究，因此，本研究通過分析EC患者PCDH8基因啟動子甲基化的異常表達情況，為EC的早期診斷和治療提供新的靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年11月至2017年10月西安交通大學第二附屬醫院和陜西省人民醫院病理科保存的74例EC患者的EC組織標本及其相應的癌旁（距腫瘤組織邊緣≥5 cm）正常組織標本。全部患者均有完整的臨床資料，均經內鏡和病理組織學檢查確診，且術前均未行化療及放療；排除合并慢性腎病、腎功能不全等疾病的患者。74例EC患者中，男41例，女33例；年齡為33～77歲，平均年齡為（54.42±7.36）歲；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期27例；世界衛生組織（World Health Organization，WHO）組織學分級：Ⅰ級16例，Ⅱ級25例，Ⅲ級33例。

1.2 儀器與試劑

Allegra TM64R型臺式高速冷凍離心機購自德國Beckman公司，OLYMPUS CX41倒置光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，DJ-3005電子分析天平購自日本SHINKO公司，DK-SD恒溫水浴搖床購自上海醫用恒溫設備廠，Mastercycler ep realplex全自動熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司，HWA-50D恒溫水浴鍋購自韓國Autonics公司，UV-8000紫外分光光度計購自上海精密儀器儀表公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，DNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，抗PCDH8單克隆抗體購自日本Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色法按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作。①按照病理編號調出西安交通大學第二附屬醫院和陜西省人民醫院病理科存檔的石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片，置于載玻片上，烘干48 h后待用；②抗原熱修復；③滅活內源性過氧化物酶；④封閉；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑顯色；⑧蘇木精復染；⑨將染色后的病理切片置于400倍視鏡下觀察，PCDH8位于細胞膜上，隨機選擇10個視野，觀察細胞的陽性表達情況。

1.3.2 組織DNA提取將組織切片脫蠟水化后，置于EP管中；加入150 μl的丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）緩沖液和10 μl的蛋白酶K振蕩混勻，置于56℃恒溫水浴鍋中15 min，80℃恒溫水浴鍋中15 min；采用鹽析法提取DNA。

1.3.3 DNA重亞硫酸氫鹽修飾及純化按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作。取2 μl DNA加入去離子水稀釋至18 μl，加入2 μl 3 mol/L的氫氧化鈉溶液，混勻，37℃孵育15 min；加入4.8 mol/L的重亞硫酸鈉 278 μl和100 mmol/L 的對苯二酚2 μl，56℃孵育4 h，將標本除鹽后加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液22 μl，37℃孵育 15 min。最后，將所得DNA經醋酸鈉和乙醇沉淀后，加入20 μl的TE溶液溶解。

1.3.4 甲基化特異性PCR 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）檢測PCDH8基因啟動子的甲基化狀態。將 21 μl的反應體系（Taq Mix10 μl+cDNA模板 2 μl+上下游引物各 1 μl+RNase-fress水 7 μl）按程序擴增：95℃3 min預變性；95℃30 s變性，60℃30 s退火，72℃5 min延伸，循環40次。引物序列如下，β-actin，334 bp，上游引物：5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；甲基化PCDH8，156 bp，上游引物：5'-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3'；下游引物：5'-AAA TCAGGCTCATTACGAAC-3'；非甲基化PCDH8，156 bp，上游引物：5'-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3'；下游引物：5'-AAAATCACACTCTTTACAAA-3'。

1.4 結果判定標準

1.4.1 免疫組化結果判定PCDH8蛋白陽性表達于細胞膜，染色呈棕黃色。①根據陽性細胞所占比例評分：陽性細所占比例為0，計0分；陽性細所占比例≤25%，計1分；陽性細所占比例為26%～50%，計2分；陽性細所占比例為51%～75%，計3分；陽性細所占比例＞75%，計4分。②根據細胞染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據染色指數（labeling index，LI）判定結果。LI=陽性細胞所占比例評分×細胞染色強度評分。將總分數分為1～4級：0～1分為 1級，2～4分為2級，5～8分為 3級，9～12分為 4級。1級和2級為PCDH8蛋白低表達，2級和3級為PCDH8蛋白高表達。

1.4.2 MSP結果判斷甲基化陽性：甲基化引物擴增陽性，非甲基化引物擴增陽性/陰性；非甲基化陽性：甲基化引物擴增陰性，非甲基化引物擴增陽性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC組織和癌旁組織中PCDH 8蛋白的表達情況

癌旁組織中可見大量細胞的細胞膜被染成黃色，而EC組織中基本未見陽性染色（圖1）。EC組織中的PCDH8蛋白的高表達率為28.4%（21/74），明顯低于癌旁正常組織的64.9%（48/74），差異有統計學意義（χ2=19.793，P＜0.01）。

圖1 癌旁組織和EC組織中PCDH 8蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.2 EC組織和癌旁組織中PCDH 8基因啟動子的甲基化狀態

MSP檢測結果顯示，EC組織中PCDH8基因啟動子甲基化率為87.8%（65/74），明顯高于癌旁正常組織的 16.2%（12/74），差異有統計學意義（χ2=76.044，P＜0.01）。

2.3 PCDH 8蛋白表達情況與EC患者臨床特征的關系

PCDH8蛋白的高表達與EC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、WHO組織學分級和淋巴結轉移情況均無關（P＞0.05）。（表1）

2.4 PCDH 8基因啟動子甲基化率與EC患者臨床特征的關系

PCDH8基因啟動子的甲基化率與EC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、WHO組織學分級、淋巴結轉移均無關（P＞0.05），但是PCDH8基因啟動子的甲基化率與EC患者的TNM分期有關（P＜0.05）。（表2）

表1 不同臨床特征EC患者EC組織中PCDH 8蛋白的表達情況（ n=74）

表2 不同臨床特征EC患者EC組織中PCDH 8基因的甲基化情況（ n=74）

3 討論

食管癌是臨床上較為常見的、病死率較高的消化系統惡性腫瘤之一，發病人群的年齡范圍較大，以鱗狀細胞癌為主，近年來，在中國，其發病率呈逐年上升趨勢[6]。由于EC發病早期缺乏典型的臨床表現，而且有研究顯示其分子水平的改變，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、信號轉導通路的調控等早于臨床表現，因此，早期診斷和干預對于逆轉食管鱗狀上皮低級別上皮內瘤變、降低EC的發病率、改善EC患者的預后具有十分重要的臨床價值[7-8]。近幾年，表觀遺傳學與腫瘤發生機制之間的關系研究一直是熱點，它與遺傳學改變不同的是，核苷酸序列未發生變化，而是通過DNA甲基化、染色體重構和組蛋白去乙酰化等調控基因的表達，參與機體的病理、生理過程[9-10]。其中，DNA甲基化在腫瘤的調控過程中發揮著重要的作用，通過抑制抑癌基因的表達，促使腫瘤細胞增殖、侵襲等。因此，抑癌基因的甲基化為腫瘤的治療提供了新的潛在靶點[11-12]。

PCDH家族是目前神經系統領域研究較為深入的細胞黏附分子家族，但是其與腫瘤的相關性研究尚少[13]。PCDH8屬于非聚集性PCDHδ2基因家族的成員之一，它除了具有神經系統的特異性細胞黏附功能外，與胃癌、鼻咽癌、膀胱癌等腫瘤的發生也密切相關[14-15]。但是，目前關于PCDH8基因與EC關系的研究較少，而本研究主要探討了PCDH8蛋白表達和基因啟動子區域甲基化水平與EC患者臨床特征的關系，為EC發病機制以及治療方法的研究提供了新的方向。本研究結果顯示，EC組織中PCDH8蛋白的高表達率明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01），但是未發現與患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、WHO組織學分級以及淋巴結轉移有關。通過分子學水平研究發現，EC組織中PCDH8基因啟動子甲基化率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.01），且與EC患者的TNM分期有關（P＜0.05）。

提示PCDH8基因啟動子區域甲基化可能發生在EC的整個疾病進展階段，是EC發生、發展的一個重要危險因素和預測指標。本研究由于納入的樣本量偏少或者病理組織保存時間過長，未發現PCDH8蛋白與EC患者臨床特征的關系以及PCDH8基因甲基化與淋巴結轉移的關系，需要進一步探討。

綜上所述，PCDH8蛋白和基因在EC組織中的表達情況，可能與基因啟動子區域甲基化有關，可作為EC診斷和治療的新靶點。