PDCD 4通過Wnt/β -catenin信號通路抑制宮頸癌細胞增殖的基礎研究

劉莉娟，邢燕，岳青芬

鄭州大學附屬洛陽中心醫院婦科，河南 洛陽471000

宮頸癌的發病率居中國女性生殖道腫瘤的首位，嚴重威脅著女性的健康[1]。據統計，全球新發宮頸癌病例約為50萬/年，其中約7/8的新發病例發生于發展中國家[2]。目前，宮頸癌患者就診時多數已處于晚期，因此尋找一種與宮頸癌早期診斷、預后判斷和靶向治療有關的生物標志物十分迫切。細胞程序性死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年來新發現的一種凋亡相關基因，在細胞程序性死亡過程起重要作用。相關研究表明，PDCD4可以抑制腫瘤的發生、發展，促進腫瘤細胞凋亡[3]。據報道，PDCD4表達水平的變化與腫瘤病理分級和預后密切相關[4]。目前，關于PDCD4對宮頸癌細胞的影響及其在宮頸癌中的作用機制的研究比較缺乏。因此，本實驗通過過表達PDCD4，檢測其對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌HeLa細胞由鄭州大學實驗室保存；DMEM培養基購自美國HyClone公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；PDCD4抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、β-連環蛋白（β-catenin）抗體、分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK1）抗體、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的抗兔二抗均購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2 細胞培養

將凍存在液氮中的HeLa細胞取出，迅速置于37℃水浴鍋中復蘇，隨后轉移至15 ml玻璃離心管中，加入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基，輕輕顛倒混勻，離心，棄上清，細胞計數，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，當細胞匯合度達70%～80%時，0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3傳代培養。

1.3 細胞轉染

取對數生長期的HeLa細胞，將培養基更換為不含抗生素的DMEM培養基，當細胞匯合度達70%～80%時，使用LipofectamineTM2000進行轉染。以加入PGC-FU-GFP-PDCD4表達載體的細胞為過表達組，以加入PGC-FU-GFP表達載體的細胞為空載體組，以未做轉染的細胞為空白對照組。將各組細胞接種于6孔板中，每孔加入5×105個細胞，加入5 μl LipofectamineTM2000和500 μl無血清培養基，振蕩混勻，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養48 h，蛋白質印跡法（Western blot）檢測轉染效果。

1.4 噻唑藍法檢測細胞增殖能力

將過表達組、空載體組和空白對照組HeLa細胞接種于96孔板中，每孔加入1×106個細胞，輕輕混勻，每組5個復孔，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養48 h后，加入20 μl MTT溶液，37℃培養4 h，待有藍色結晶紫產生，加150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37℃、避光，搖床振蕩10 min，使用酶標儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值（OD值），計算細胞存活率。實驗重復3次，取平均值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡能力

采用不含EDTA的胰蛋白酶消化過表達組、空載體組和空白對照組HeLa細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 2次，收集（1～5）×105個細胞，加入 500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC，振蕩混勻，室溫下避光培養5 min，采用流式細胞儀測定各組細胞的凋亡情況，實驗重復3次，取均值。

1.6 Western blot檢測細胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白的表達

取過表達組、空載體組和空白對照組HeLa細胞，加入 300 μl RIPA、3 μl蛋白酶抑制藥，充分搖勻，置于冰上反應30 min，收集蛋白轉入干凈的EP管中，根據BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測蛋白濃度；使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠和5%SDSPAGE濃縮膠電泳，每孔大約加入30 μg的蛋白質，沸水浴5 min，電泳；取下凝膠，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上；置于含5%脫脂奶粉的TBST液封閉1 h，加入一抗（分別加入β-actin一抗，1∶1000；PDCD4一抗，1∶1000；β-catenin一抗，1∶400；DKK1一抗 1∶400；cyclin D1一抗1∶1000），置于37℃、搖床中孵育1 h，4℃過夜培養；TBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標記的抗兔二抗（1∶5000），室溫培養1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；暗室中，滴加ECL發光液，采用凝膠成像儀掃描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0統-計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效果

Western blot檢測結果顯示：轉染后，過表達組、空載體組和空白對照組細胞中PDCD4蛋白的相對表達量分別為（1.53±0.12）、（0.41±0.07）和（0.39±0.04），3組比較，差異有統計學意義（F=287.0，P＜0.01）。其中，空載體組細胞中PDCD4蛋白的相對表達量與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；過表達組細胞中PDCD4蛋白的相對表達量高于空白對照組和空載體組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 Western blot檢測轉染后 3組細胞中PDCD 4蛋白的表達

2.2 PDCD 4過表達對細胞增殖能力的影響

MTT法檢測結果顯示：過表達組、空載體組和空白對照組細胞的存活率分別為（40.5±3.8）%、（96.5±6.2）%和（100.0±4.4）%，3組比較，差異有統計學意義（F=229.6，P＜0.01）。其中，空載體組細胞的存活率與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；過表達組細胞的存活率低于空白對照組和空載體組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 PDCD 4過表達對細胞凋亡能力的影響

流式細胞儀檢測結果顯示：過表達組、空載體組和空白對照組細胞的凋亡率分別為（48.6±4.3）%、（12.4±1.4）%、（10.5±1.2）%，3組比較，差異有統計學意義（F=316.6，P＜0.01）。其中，空載體組細胞的凋亡率與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；過表達組細胞的凋亡率高于空白對照組和空載體組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 不同組別HeLa細胞的凋亡情況

2.4 PDCD 4過表達對HeLa細胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白表達水平的影響

Western blot檢測結果顯示：過表達組、空載體組和空白對照組細胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。其中，空載體組細胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達水平與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；過表達組細胞中βcatenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達水平均低于空白對照組和空載體組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖3、表1）

圖3 Western blot檢測 3組細胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1的表達

表1 3組細胞中β -catenin、DKK 1、cyclin D 1表達量的比較（±s）

表1 3組細胞中β -catenin、DKK 1、cyclin D 1表達量的比較（±s）

注：*與過表達組比較，P＜0.05

組別空白對照組空載體組過表達組F值P值β-catenin 0.78±0.09*0.77±0.11*0.34±0.06 38.69＜0.01 DKK1 0.84±0.10*0.85±0.10*0.31±0.08 52.20＜0.01 cyclin D1 0.66±0.07*0.69±0.08*0.30±0.08 41.26＜0.01

3 討論

PDCD4基因位于10q24，其編碼蛋白約含有469個氨基酸，可以影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程，抑制腫瘤的惡化[5]。PDCD4表達水平的升高或降低均對腫瘤細胞的生長、凋亡等過程產生較大影響。Matsuhashi等[6]研究表明，PDCD4可以通過調控轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導原發性肝癌細胞凋亡。在卵巢癌中，異常表達的PDCD4可以通過調節p21和p27基因的表達，使卵巢癌細胞停滯在G1期或上調細胞周期，進而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的[7]。PDCD4在鼻咽癌組織中的表達水平低于正常黏膜組織，穩定地過表達PDCD4可以削弱腫瘤細胞的存活力，抑制腫瘤細胞增殖，從而使體內成瘤速度明顯減慢[8]。在血液惡性腫瘤中，PDCD4mRNA和蛋白的表達水平降低，表明PDCD4參與阻滯血液惡性腫瘤患者骨髓單個核細胞凋亡過程，促進血液惡性腫瘤的發生、發展[9]。毛玲等[10]研究發現，苦參堿體外作用于人腎母細胞瘤細胞可以提高PDCD4的表達水平及增加腫瘤細胞的敏感度和凋亡率。PDCD4在宮頸癌細胞的細胞核和細胞質中均有表達[11]，但關于PDCD4對宮頸癌細胞增殖和凋亡的調控以及作用機制的報道較少。本研究通過對宮頸癌HeLa細胞轉染PGCFU-GFP-PDCD4和PGC-FU-GFP表達載體發現，過表達組細胞中PDCD4蛋白的相對表達量高于空轉染組和空白對照組（P＜0.05），細胞的存活率低于空白對照組和空載體組（P＜0.05），細胞的凋亡率高于空白對照組和空載體組（P＜0.05），表明PGCFU-GFP-PDCD4載體可以促進HeLa細胞中PDCD4的表達，而過表達的PDCD4可以抑制HeLa細胞的增殖，促進HeLa細胞的凋亡，其可能原因為PDCD4阻礙了腫瘤細胞的有絲分裂過程，但PDCD4的具體作用機制尚未完全清楚。

Nusse等[12]報道中將小鼠乳腺瘤原癌基因int1和果蠅無翅基因wingless合稱為Wnt。Wnt信號通路調控胚胎發育和機體正常生理過程，同時誘導多種腫瘤的發生、發展[13]。Wnt/β-catenin信號通路是Wnt信號通路的經典途徑，該通路在細胞的生長、遷移過程中發揮重要作用，主要是提高βcatenin的表達水平并向細胞核內轉移，其作用原理為Wnt蛋白通過與細胞表面因子結合形成三聚體，并活化細胞質內蓬亂蛋白，抑制β-catenin磷酸化降解，提高細胞質中β-catenin的含量，細胞質的通透性增強，β-catenin進入細胞核與T細胞轉錄因子/淋巴樣增強因子相互作用，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進下游靶基因的表達，調控腫瘤的發生、發展、細胞生理過程及耐藥性等[14-15]。DKK1、cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因[16]。DKK1可以誘導產生具有內吞功能的三元復合物，阻斷Wnt/β-catenin信號轉導途徑，誘導多種腫瘤細胞凋亡[17]。cyclin D1能特異性調控細胞從G1期向S期轉換，cyclin D1低表達可以抑制腫瘤的發生、發展[18]。本實驗通過Western blot檢測轉染后HeLa細胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表達水平發現，與空白對照組和空轉染組相比，過表達組細胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的相對表達量均降低，表明PDCD4可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化和細胞周期G1/S期的轉換，從而抑制腫瘤細胞的增殖。

綜上所述，PDCD4通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路激活下游靶基因的表達，從而抑制宮頸癌細胞增殖，促進宮頸癌細胞凋亡。PDCD4可以作為一種抑癌基因，調控腫瘤的發生、發展，為宮頸癌的診斷、治療提供理論依據。