MED19基因對體內胃癌細胞增殖抑制作用機制的探討△

丁相福，王婷婷，許崴崴，袁偉杰，徐廣甍，魏士雄

吉林大學第二醫院1甲狀腺外科，2腫瘤血液科，3結直腸外科，長春130041

4長春市南關區醫院綜合外科，長春130000

5復旦大學上海醫學院臨床醫學系，上海200433

中介體（mediator）最早發現于酵母菌中，是由多個蛋白質亞基組成的生物大分子復合物，屬于RNA聚合酶Ⅱ通用轉錄裝置的基本組分，在真核生物mRNA合成的活化和抑制中發揮關鍵作用[1]。酵母的中介體由25個亞基組成[2]，其中21個亞基組成核心結構，包括頭部、中部和尾部組件[3]；4個亞基組成特別組件，對RNA聚合酶Ⅱ的活力進行調節。哺乳動物中介體的亞基組成及其相關活性已經確定，目前已鑒定30余種亞基，其中多數亞基與酵母的中介體亞基存在廣泛的同源性[4-5]。

MED19是中介體中的一個亞單位，又稱肺癌轉移相關蛋白1（lung cancer metastasis related protein 1，LCMR1），最初從高轉移肺癌中克隆得到，已被證實參與細胞信號由胞外向胞內轉導。抑制MED19基因表達，可引起某些調節細胞生長、分化和凋亡的基因的表達發生改變，提示MED19可能參與細胞的周期調控、信號轉導或轉錄調控[6]。本研究利用慢病毒介導的RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術在離體胃癌SGC-7901組織細胞中沉默MED19基因，旨在觀察其影響胃癌組織細胞增殖和細胞周期的能力，從而對MED19基因在胃癌中的功能進行驗證。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及瘤體獲得

1.1.1 動物模型建立選擇分化程度差且轉移能力強的SGC7901胃癌細胞株（購自上海吉凱基因科技有限公司），經復蘇及傳代后置入培養瓶中備用。將SGC7901胃癌細胞分為3組：空白對照組，正常培養的SGC7901胃癌細胞，不用病毒顆粒轉染；陰性對照組，用陰性對照病毒顆粒轉染；病毒干擾組，用MED19shRNA慢病毒顆粒轉染。裸鼠為BALB/C-nu/nu裸鼠，共36只，鼠齡4～6周，雌雄各半，平均體重18～25 g，飼養于SPF級屏障動物實驗室[SYXK（吉）2007-0011]，喂養環境、溫度、條件均符合實驗要求。將裸鼠隨機分成3組，每組12只，3組裸鼠的性別、鼠齡及體重比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。3組裸鼠分別以control組、negative組及shRNA組標記，按照組別將各組裸鼠分別移至超凈臺，用碘伏消毒待接種部位，混勻細胞懸液，選擇裸鼠右側腋下皮下為接種部位，分別抽取空白對照組、陰性對照組、病毒干擾組SGC7901細胞0.2 ml接種于control組、negative組及shRNA組裸鼠的接種部位，形成約3 mm皮丘，注射后局部壓迫片刻。

1.1.2 獲取動物模型腫瘤細胞每日觀察裸鼠是否感染、出瘤時間、瘤體生長情況及腫瘤是否自然消退。成瘤的判斷標準：腫瘤直徑≥3 mm。全部成瘤率為83.3%。成瘤體積取平均值，每7天記錄1組數值。全部裸鼠成活良好，腫瘤生長良好。成瘤35 d后，提取裸鼠胃癌組織SGC7901細胞，備下一步實驗用。提取胃癌組織SGC7901細胞后全部裸鼠脫頸處死，沿腫瘤背膜完整剝離胃癌移植瘤備其他實驗用。

1.2 慢病毒介導RNAi沉默MED19基因的效率驗證

分別抽提3組裸鼠胃癌組織SGC7901細胞的總RNA，以β-actin為內參，采用蛋白質印跡法（Western blot）驗證MED19蛋白表達水平的變化，采用實時聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR）檢測shRNA慢病毒對MED19mRNA表達的抑制作用。

1.3 MTT法檢測細胞增殖情況

分離3組裸鼠胃癌組織SGC7901細胞，取對數生長期的細胞進行接種，選取96孔板，每孔接種2000個細胞，每組5個復孔，接種5塊復板。以波長570 nm處的吸光度值反映細胞增殖情況，細胞活力越強，OD570nm值越大。連續檢測5 d，以培養時間為橫坐標，以OD570nm值為縱坐標，繪制各組細胞的生長曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期

將3組裸鼠胃癌組織SGC7901細胞分別接種于6孔板中，先用胰蛋白酶消化，后進行細胞固定，待細胞未脫落呈圓形時，終止完全培養基。采用4℃預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細胞，沉淀2次，2000 r/min離心5 min，收集細胞，然后加入70%的冰冷乙醇1 ml固定細胞，調整溫度至4℃，搖床振蕩過夜培養。此后，采用冰PBS再次洗滌細胞2次，2000 r/min，離心5 min，收集細胞。1 ml冰PBS溶液重懸細胞沉淀，隨后在P（I1∶40）及RNase（1∶100）中分別將其加入，冰浴15 min，并應避光進行，上機進行流式檢測。

2 結果

2.1 慢病毒介導MED19基因沉默效果的檢驗

RT-PCR檢測結果顯示：shRNA組裸鼠胃癌組織SGC7901細胞中MED19mRNA的基因抑制率為79.3%（圖1A）。Western blot檢測結果顯示：shRNA組裸鼠胃癌組織SGC7901細胞中MED19蛋白的表達水平為（0.23±0.11），低于negative組和control組的（1.03±0.21）、（0.95±0.13），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 control組、negative組和shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞中MED19 mRNA和蛋白的表達情況

2.2 shRNA慢病毒介導MED19沉默對裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞增殖作用的影響

MTT法檢測結果顯示：不同時間點，control組和negative組裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞的增殖能力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與control組和negative組相比，shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞的增殖能力在第3～5天降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

2.3 沉默MED19基因對裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示：shRNA組胃癌組織SGC-7901細胞的G1期細胞所占比例高于con-trol組和negative組，G2/M期細胞所占比例低于control組和negative組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

圖2 不同時間點control組、negative組和shRNA組裸鼠胃癌組織SGC-7901細胞的增殖情況

表1 control組、negative組和shRNA組不同細胞周期胃癌組織SGC-7901細胞所占比例的比較（%，±s）

表1 control組、negative組和shRNA組不同細胞周期胃癌組織SGC-7901細胞所占比例的比較（%，±s）

注：a與control組比較，P＜0.05；b與negative組比較，P＜0.05

組別control組negative組shRNA組G1期56.0±0.8 58.2±0.7 71.2±0.8a b G2/M期15.0±0.9 15.0±0.7 7.5±0.7a b S期28.9±0.8 26.7±0.9 21.3±0.3

3 討論

胃癌是人類較常見的胃腸道惡性腫瘤之一。據流行病學調查結果顯示，在世界范圍內，因胃癌導致死亡的概率在惡性腫瘤中居第2位，目前發現中國、日本等國家占有全球約60%的胃癌新發病例[7]。目前，針對胃癌的治療，外科手術仍然是最有效的方式，但是近年來的統計數據顯示，胃癌患者術后5年的生存率仍然較低。2009年統計結果顯示，胃癌患者術后5年的總體生存率低于25%[7]。從分子生物學的角度考慮，胃癌的發生過程是一個多步驟、多階段的效應過程，主要以癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活為基礎，通過癌基因和（或）抑癌基因表達產物的改變，導致細胞出現如惡性增殖、去分化和侵襲性生長等特征，導致癌變的發生。因此，基于上述理論，設想如果能實現對這一主要基礎變化的控制，即對癌基因激活和（或）抑癌基因失活的控制，就能夠使腫瘤的發生被阻斷。這也是近年來胃癌治療領域的主要研究目標。RNAi技術具有高效性、特異性和低毒性等特點，使得該技術自應用以來在反向基因組學、基因治療、抗腫瘤、抗病毒、抗遺傳性疾病以及胚胎干細胞的研究等多項研究中顯示出了巨大的潛力[8-9]。

MED19基因是在對CYC7基因突變進行觀察時發現的[10]。相關研究證實，中介體和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亞基是MED19基因所編碼的產物[11]。而酵母RNA聚合酶Ⅱ的頭部組件是由MED19/ROX3構成的[12-13]。當MED19/ROX3片段缺失后，中介體中部組建的解離情況出現，僅保留了由頭部和尾部模塊組成的亞復合體，這也提示了中部組件在中介體的位置，MED19基因對其起到了穩定作用，而不會影響頭部和尾部組件。另一研究證實，MED19/ROX3突變后，MED19/ROX3中介體對RNA聚合酶Ⅱ的親和力明顯下降，無法刺激RNA聚合酶Ⅱ亞基羥基端結構域，導致其磷酸化[14]。還有研究表明，MED19基因被確定為沉默轉錄因子RE1操縱的調控裝置的重要組分[15]。

目前，還在不斷完善和研究關于MED19基因在腫瘤組織中的特性，本研究組的前期研究已經證實了MED19基因在胃癌組織中的特性問題，并且也已經進行了詳細闡述，研究證實MED19基因在腫瘤組織中的高表達具有特異性，這是通過免疫組化方法實現的，觀察并證實MED19基因的表達上調可能與胃癌的發生存在一定的關聯性。但該研究尚未闡明MED19基因對細胞增殖和細胞周期的影響[16]。本研究采用RNAi技術對MED19基因進行沉默后，通過一系列實驗及方法對胃癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的變化進行了觀察，MTT法檢測結果表明，與control組和negative組相比，shRNA組胃癌組織SGC-7901細胞的增殖能力在第3～5天降低（P＜0.05），說明對照序列的慢病毒，也可以說慢病毒本身對SGC-7901細胞增殖能力并沒有影響，而MED19基因沉默因shRNA慢病毒的介導而導致了SGC-7901細胞中細胞增殖能力下降。流式細胞儀檢測細胞周期變化顯示，與control組和negative組相比，shRNA組胃癌組織SGC-7901細胞的細胞周期阻滯于G1期，使細胞復制能力明顯降低，這也驗證了MED19基因的表達可以起到對胃癌細胞增殖的促進作用。在利用MGC803細胞進行的體外實驗中，同樣也得到了如上所述的結論[17]。

綜上所述，沉默胃癌細胞MED19基因，能夠對胃癌細胞的惡性表征起到有效地抑制作用，MED19基因在胃癌的靶向治療和基因治療中，很可能成為有效的靶點，但這還有待進一步研究證實，具有良好的應用前景。