成纖維細(xì)胞激活蛋白靶向治療的研究進(jìn)展△

邱婉芳，侯宗柳，石劍林，梁陸鑫，楊芳#

1昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，昆明650500

2昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院科研部，昆明650500

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，它除了與腫瘤細(xì)胞自身的因素（各種癌基因的激活及抑癌基因的失活）有關(guān)，還涉及腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境[1]。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的成分與腫瘤細(xì)胞之間的相互刺激作用是腫瘤進(jìn)展的決定性因素。TME是腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，是一個包括腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、微血管、微淋巴管、組織液、免疫細(xì)胞及各種細(xì)胞因子和趨化因子等的復(fù)雜系統(tǒng)[2]。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma associated fibroblast，CAF）是起源于骨髓和局部組織的成纖維細(xì)胞，它是在腫瘤細(xì)胞及TME中各種因素的刺激下形成的一種“激活狀態(tài)”的特殊成纖維細(xì)胞，其具有極強(qiáng)的增殖、遷移、分泌細(xì)胞因子和合成各種細(xì)胞基質(zhì)蛋白的能力，是TME的主要組成部分。CAF可通過分泌細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子及細(xì)胞外基質(zhì)降解酶等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)腫瘤微血管的生成。正因為CAF對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用巨大，因此，對CAF進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究將會對惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷產(chǎn)生重大的意義[3]。CAF表面的分子標(biāo)志物包括成纖維細(xì)胞激活蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）、α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白（vimentin）等。由于α-SMA和vimentin在靜息成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞中也有表達(dá)，而FAP僅在激活的成纖維細(xì)胞中呈高度特異性表達(dá)，因此，F(xiàn)AP成為CAF最具潛力的分子標(biāo)志物。此外，F(xiàn)AP還是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、誘導(dǎo)新生血管生成、介導(dǎo)免疫抑制、參與腫瘤細(xì)胞能量代謝等必不可少的因素[4]。目前，已有將腫瘤和TME的關(guān)系比喻為“種子”和“土壤”的說法，針對“種子”治療效果不佳的現(xiàn)狀，人們開始從“土壤”中尋找新的治療方法。因此，本文主要針對以FAP為靶點的相關(guān)研究、治療進(jìn)展及其與TME的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 CAF與FAP

成纖維細(xì)胞為靜息的間充質(zhì)干細(xì)胞，可向功能性成纖維細(xì)胞分化。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞成為激活成纖維細(xì)胞。激活成纖維細(xì)胞是一種稀有的間質(zhì)細(xì)胞，具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的潛能，并能被誘導(dǎo)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。腫瘤組織中的激活成纖維細(xì)胞又稱CAF，通過活躍的分泌活動調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，如分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromalcell derived factor-1，SDF-1，又稱CXCL12）招募骨髓來源的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤血管的生成；分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運動、侵襲。CAF還可通過尿激酶型纖溶酶原激活物受體（uroki-nase-type plasminogen activator receptor，uPAR）上調(diào)CC類趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2），從而趨化髓系來源的免疫抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC），造成TME的免疫抑制狀態(tài)。TME免疫抑制狀態(tài)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抵抗，導(dǎo)致腫瘤治療無效及腫瘤復(fù)發(fā)等[5]。

在慢性愈合的傷口、纖維化組織和基質(zhì)活化的腫瘤組織中，激活成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，并高表達(dá)FAP。FAP既是CAF的重要分子標(biāo)志物，又是腫瘤進(jìn)展過程中必不可少的因素。FAP具有蛋白酶活性和參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重功能。作為CAF細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，F(xiàn)AP分為胞質(zhì)區(qū)和胞外區(qū)。其中，胞外區(qū)由α/β催化結(jié)構(gòu)域和β螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)組成，而α/β催化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）和肽鏈內(nèi)切酶活性。FAP單體分子量為95 kD，只有裝配成170 kD的二聚體才具有完整的酶活性。FAP是Ⅱ型絲氨酸蛋白酶家族的成員之一，具有膠原酶和DPP活性，在腫瘤的生長過程中具有雙重功能，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的二肽和Ⅰ型膠原[6]。除酶活性外，F(xiàn)AP還具有非酶催化活性。Knopf等[7]在人結(jié)腸癌CAF上，利用免疫共沉淀聯(lián)合敲除技術(shù)證實FAP是實體瘤細(xì)胞外基質(zhì)脂筏的整體構(gòu)件之一，與caveolin-1、erlin-2及stomatin等形成脂筏復(fù)合物，從而重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促使腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。

FAP的表達(dá)具有腫瘤組織分布的特異性：①FAP選擇性表達(dá)于90%以上的惡性上皮性腫瘤（如乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等）基質(zhì)中的CAF中，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)[8]；②FAP也可存在于上皮性腫瘤中，如胃癌和宮頸癌等[9]；③FAP在正常組織中通常不表達(dá)，但可一過性地出現(xiàn)在一些胚胎間葉組織和一些細(xì)胞外基質(zhì)活化的疾病中[8]。FAP在激活成纖維細(xì)胞中呈高度特異性表達(dá)，使得其成為腫瘤與TME相互作用的靶蛋白。

2 FAP與TME

腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤細(xì)胞本身有關(guān)，還受TME的控制。在TME中，腫瘤細(xì)胞與CAF具有復(fù)雜的相互作用，具體機(jī)制如下：①FAP對腫瘤間質(zhì)的形成、再塑和維持起重要作用，F(xiàn)AP可發(fā)揮蛋白質(zhì)水解酶的作用，直接溶解與其相鄰的細(xì)胞外基質(zhì)，也可通過激活另一種蛋白酶原間接溶解細(xì)胞外基質(zhì)[10]。此外，F(xiàn)AP能夠與DPPⅣ、MMP-1、MMP-2、尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）等結(jié)合形成復(fù)合物，作用于細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[11-12]。②FAP的DPP活性能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮類似血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的作用，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成[12]；FAP在細(xì)胞表面參與介導(dǎo)一些促腫瘤新生血管生成的信號通路，促進(jìn)生長因子發(fā)揮促新生血管生成的作用；FAP參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重建，使膠原異常積聚，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移并逐漸形成血管[13]。阻礙FAP的表達(dá)可引起γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等抑制血管形成的細(xì)胞因子水平升高，從而導(dǎo)致腫瘤組織缺氧、壞死[14]。TME中存在導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答弱或不應(yīng)答的因素，而FAP正是其中的關(guān)鍵因素之一[15]。FAP+CAF主要通過分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的生成，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)答，形成有利于腫瘤逃逸的微環(huán)境。FAP+CAF可通過分泌或促進(jìn)分泌TGF-β、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、PDGF、CXC類趨化因子配體2（CXC chemokine ligand 2，CXCL2）和 CCL2等，促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）、腫瘤相關(guān)樹突狀細(xì)胞、MDSC及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞的生成[16]。同時，F(xiàn)AP+CAF可誘導(dǎo)TME免疫抑制狀態(tài)，阻止免疫細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞，如干擾樹突細(xì)胞的分化成熟、阻斷T細(xì)胞向細(xì)胞毒性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)換及抑制MHC抗原表達(dá)等[17]。實驗表明，破壞FAP+CAF既能改善機(jī)體對抗腫瘤的免疫功能，又能增強(qiáng)抗腫瘤藥物的功效[18]。

3 靶向FAP治療策略

FAP與腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及免疫抑制等關(guān)系密切，因此，以FAP為靶點，圍繞其在TME中的作用，一些腫瘤生物治療的新方法應(yīng)運而生。目前，靶向FAP的治療策略包括以下幾種。（圖 1）

圖1 以FAP為靶點的免疫治療策略

3.1 FAP小分子酶抑制藥

如前所述，F(xiàn)AP具有膠原酶和DPP雙重蛋白酶活性，與TME細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重建、腫瘤脈管系統(tǒng)的建立關(guān)系密切。因此，推測選擇性抑制FAP蛋白酶活性可以減緩腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。研究者們嘗試通過使用FAP蛋白酶抑制藥來減緩腫瘤的進(jìn)展。其中，ValboroPro（也稱Talabosta）是第1個進(jìn)行臨床試驗的FAP蛋白酶活性抑制藥，Ⅱ期試驗已在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌患者中開展[19]。但ValboroPro仍存在很多問題：應(yīng)用ValboroPro抑制FAP蛋白水解酶活性的同時，也可能抑制了包括FAP在內(nèi)的其他絲氨酸蛋白酶家族的酶活性；ValboroPro在生理條件下極易發(fā)生環(huán)化，到達(dá)腫瘤部位可能已經(jīng)失效。雖然該藥物的療效目前尚無法確定，但鑒于FAP蛋白酶水解活性在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，F(xiàn)AP仍是一個潛在的治療靶點，F(xiàn)AP小分子蛋白酶活性抑制藥還有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 FAP酶激活式前體藥物

FAP酶激活式前體藥物的設(shè)計思路是通過將細(xì)胞毒性藥物與特殊肽鏈形成暫時失活的前體藥物，當(dāng)該藥物被輸送至腫瘤組織時，F(xiàn)AP的肽鏈內(nèi)切酶活性可使細(xì)胞毒性藥物釋放并殺傷靶細(xì)胞。毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）能夠引發(fā)細(xì)胞間鈣離子水平的上升和細(xì)胞凋亡。有研究在裸鼠實驗中利用FAP激活肽-TG前體藥物殺傷TME中的FAP+CAF，從而產(chǎn)生治療腫瘤的作用[20]。但靜脈注射這種前體藥物是否對正常組織存在損傷目前仍存在爭議。由于抑制FAP酶活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的雙重功能存在一定的技術(shù)難度。因此，相較于同時抑制FAP酶活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，利用FAP特異性前體藥物與FAP接觸釋放細(xì)胞毒性藥物，從而殺傷FAP+CAF和腫瘤細(xì)胞可能更具有腫瘤治療價值。

3.3 以FAP為靶點的CAR-T細(xì)胞療法

如前所述，F(xiàn)AP+CAF可使TME處于免疫抑制狀態(tài)，是腫瘤治療的阻力之一。因此，可以CAF和腫瘤細(xì)胞為靶點治療實體瘤。采用基因修飾T細(xì)胞，使其表達(dá)特異性FAP嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），以FAP為靶點的CAR-T細(xì)胞能夠特異性識別并殺傷FAP+CAF。Tran等[21]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP可同時表達(dá)于CAF和多能骨髓間質(zhì)細(xì)胞上，并可被以FAP為靶點的CAR-T細(xì)胞識別。Kakarla等[22]在A549肺癌模型中，利用以FAP為靶點的CAR-T細(xì)胞特異性識別FAP+CAF，并通過釋放細(xì)胞因子和發(fā)揮細(xì)胞溶解作用殺傷FAP+CAF，結(jié)果顯示，采用CAR將T細(xì)胞定向至TME，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤作用，F(xiàn)AP+CAF減少的同時，腫瘤生長緩慢。

3.4 FAP疫苗

有研究者在B16小鼠黑色素瘤模型中，設(shè)計了一種新型藥物FAP-PE38，聯(lián)合多抗原疫苗，以CAF為靶點治療小鼠黑色素瘤，結(jié)果表明該藥物具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，這種聯(lián)合治療的機(jī)制是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)抑制TME，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性識別和殺傷腫瘤細(xì)胞[23]。另有研究者給小鼠移植瘤模型注射來源于FAP的多肽疫苗FAPτ后，小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ表達(dá)水平較高，F(xiàn)APτ能夠有效激活體液和細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[24]。

3.5 FAP雙特異性抗體

為了抑制FAP的功能，研究者們進(jìn)行了多種FAP抗體的臨床試驗。西羅珠單抗（sibrotuzumab）是最早進(jìn)入臨床試驗的FAP抗體，一期臨床試驗在轉(zhuǎn)移性肝癌患者中完成，二期臨床試驗在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中完成，試驗結(jié)果顯示該抗體在人體內(nèi)的耐受性及安全性均較高，但是臨床應(yīng)答較低[25]。盡管如此，更有效的FAP抗體研究仍在繼續(xù)：①生物特異性單鏈抗體ScFvs是一種雙價抗體，能夠以FAP和T細(xì)胞CD3受體為靶點，啟動和調(diào)控TME免疫應(yīng)答[26]；②RG7386是一種以FAP+CAF和腫瘤細(xì)胞上DR5受體為靶點的雙特異性抗體。腫瘤細(xì)胞由于凋亡調(diào)控失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抵抗，因此，腫瘤細(xì)胞可逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。RG7386通過結(jié)合FAP+CAF和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上DR5受體，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號，選擇性殺傷FAP+CAF和腫瘤細(xì)胞，引發(fā)FAP過表達(dá)的實體瘤退化[27]。FAP抗體可聯(lián)合其他抗腫瘤藥物如伊立替康或阿奇霉素治療腫瘤，也可單獨治療腫瘤。

目前，越來越多的FAP靶向藥物進(jìn)入試驗階段，或單獨作用或聯(lián)合其他抗腫瘤藥物作用，為腫瘤治療帶來了新的思路。

4 小結(jié)與展望

目前，越來越多的證據(jù)表明CAF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性和能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。由于CAF的高度異質(zhì)性，在不同的腫瘤背景和腫瘤進(jìn)展階段下，CAF所起的作用不盡相同，未來尚需更深入的研究。

FAP作為CAF表面重要的標(biāo)志物之一，因靶點豐富且基因穩(wěn)定，成為抗腫瘤藥物的新靶點。目前出現(xiàn)了以抑制FAP的酶活性、破壞FAP參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或殺傷FAP+CAF等腫瘤治療策略。但以FAP為靶點的腫瘤治療仍存在諸多問題。FAP在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用存在爭議，相關(guān)分子機(jī)制尚未完全闡明。雖然目前大部分實驗支持其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，但在小鼠腫瘤模型中敲除該基因后并未使小鼠的生存情況有所改善，提示FAP具有復(fù)雜的分子機(jī)制。此外，大部分FAP靶向治療藥物試驗是在體外進(jìn)行的，并且僅針對某一實體瘤，并不能完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)TME，也無法確定其是否適用于所有實體瘤，因此需要更多的臨床前期和臨床試驗來評估FAP靶向藥物的有效性、特異性和安全性。盡管FAP的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但由于FAP高表達(dá)于上皮性腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)，使其可能成為監(jiān)測一些腫瘤發(fā)生和預(yù)后的指標(biāo)，同時，諸多研究均證實FAP靶向藥物單獨或聯(lián)合其他藥物使用能夠解除腫瘤藥物抵抗，這為未來臨床腫瘤的治療帶來了新的希望。總之，繼續(xù)深入研究FAP、CAF和TME三者的關(guān)系，有利于更加全面地了解腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制，為腫瘤的治療提供更加充分的理論和實驗依據(jù)。