針灸對CTX小鼠骨髓細胞DNA修復基因XRCC1和ADPRT的調控作用?

于冬冬，牛云云，路 玫，付雪鴿，滕迎春

(1. 河南中醫藥大學針灸推拿學院, 鄭州 450008； 2. 河南中醫藥大學國際教育學院, 鄭州 450008；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450000)

環磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是目前廣泛應用于腫瘤化療的一類烷化劑藥物,其在殺傷腫瘤細胞作用的同時，可引起正常細胞尤其是增殖旺盛的骨髓造血干細胞DNA鏈內和鏈間的交叉連接，干擾其轉錄與復制，從而造成DNA的損傷，最終導致骨髓抑制。受損細胞DNA主要通過修復和凋亡來保護其正常的生理功能和穩定的遺傳性狀[1]。堿基切除修復(base excision repair，BER)是主要的DNA損傷修復途徑，其對烷化劑、電離輻射和類輻射藥物等導致的單鏈斷裂具有修復作用。作為BER的主要參與者，XRCC1編碼的蛋白質與DNA連接酶Ⅲ相互作用，可修復DNA單鏈斷裂。研究表明，XRCC1在腫瘤細胞中的表達陽性率越高，則DNA修復能力越強[2]。ADPRT作為堿基切除修復系統的核心蛋白成員，激活后與XRCC1相互作用共同完成DNA損傷修復過程。課題組前期研究已證實，針灸可顯著上調化療機體骨髓細胞DNA切除修復蛋白-polβ的蛋白表達及RNA轉錄，提高堿基切除修復能力，發揮其抗CTX化療損傷，改善骨髓抑制的作用[3]。本研究通過觀察針灸干預后XRCC1、ADPRT的含量變化，探討針灸抗骨髓抑制又一新的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級雄性昆明種(KM)小鼠40只(由鄭州大學醫學院提供，SCXK(豫)2010-0002)，體質量(20±2) g，按體質量隨機分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組各10只，均在清潔級動物實驗室分籠飼養，每籠5只，飼養溫度21～ 25 ℃，相對濕度60%，光照時間12 h，國家標準固體混合飼料喂養，自由飲食。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 注射用環磷酰胺(山西普德藥業有限公司生產)0.9%NaCl溶液(山東魯抗辰欣藥業有限公司)；小鼠XRCC1、ADPRT ELISA檢測試劑盒(河南華豫教學實驗儀器用品營銷部提供)；過氧化物酶(HRP，上海晶純生化科技股份有限公司生產)；四甲基聯苯胺(TMB，上海晶純生化科技股份有限公司生產)。

1.2.2 儀器 超凈工作臺、凍存管、EP管、薄片離心機 SHANDON、槍頭、電子天平、移液器，1 mL、5mL一次性注射器，秒表、醫用橡膠手套、燒杯、鼠板、鼠夾(自制)、華佗牌針灸針(規格0.19 mm×10 mm，蘇州醫療器械用品有限公司生產)、特制美容艾條(規格0.4 cm×25 cm，河南南陽臥龍艾絨廠生產)等。

1.3 造模

采用環磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型，除空白組外，其余各組腹腔注射CTX100 mg/(kg·d)(按照小鼠體質量0.02 ml/g用藥量，注射濃度為5 mg/mL的CTX溶液)，后分別在首次注藥的24 h、48 h后再行CTX注射，連續3 d停藥4 h后模型即成[4]。 空白組腹腔注射等量0.9%NaCl溶液。

1.4 取穴及治療方法

取穴：大椎、膈俞、腎俞、足三里。小鼠穴位定位參考《中國獸醫針灸學》[5]，并模擬大鼠穴位定位法，大椎位于背部正中第7頸椎與第1胸椎之間；膈俞位于第7胸椎下兩旁，肋間左右側各1穴；腎俞在第2腰椎下兩旁，左右側各1穴；足三里位于小鼠后肢膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處，左右各1穴[6]。

針刺組按照各組造模時間的先后順序，造模完成后施以針刺治療，各組小鼠配對同時進行，采用管式進針法直刺，進針3 mm，留針6 min。艾灸組在造模完成后開始艾灸治療，各組配對同時進行，用美容細艾條點燃后，在距離穴位皮膚2 cm處固定懸灸3 min。模型組、空白組每日抓取陪同固定6 min，不予治療，均每日1次，連續5 d。

1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測CTX小鼠骨髓細胞中基因XRCC1和ADPRT含量

治療5 d結束后于第6天取材。在超凈工作臺上取雙側股骨剔除肌肉和結締組織，經0.9%氯化鈉溶液沖洗2遍后，用無菌眼科小剪刀上端剪口，用5 mL注射器抽取3.6 mL的0.9%氯化鈉溶液注入骨髓腔，反復2～3遍沖洗其全部有核細胞，離散成單個細胞懸液，將骨髓細胞懸液注入凍存管內密封好，再放入-80 ℃低溫冰箱保存，以備檢測骨髓細胞中XRCC1和ADPRT的含量。用ELISA法進行檢測：①從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃鋁箔袋中；②設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；③樣本孔先加待測樣本 10 μL，再加樣本稀釋液40 μL(即樣本稀釋5倍)，空白孔不加；④除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體 100 μL， 用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；⑤棄去液體吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液靜置1 min，甩去洗滌液吸水紙拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)；⑥每孔加入底物 A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min；⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD 值。

1.6 統計學方法

2 結果

表1顯示，與空白組比較，模型組、針刺組和艾灸組小鼠骨髓細胞DNA中XRCC1、ADPRT表達含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明CTX化療致小鼠骨髓細胞DNA受損；與模型組比較，針刺組和艾灸組小鼠骨髓細胞DNA中XRCC1、ADPRT表達含量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，說明針刺和艾灸能夠上調CTX化療小鼠骨髓細胞DNA中XRCC1與ADPRT的表達含量，提高細胞DNA堿基切除修復能力，對抗CTX化療所致細胞DNA損傷，減輕骨髓抑制。與艾灸組比較，針刺組XRCC1、ADPRT含量較高，差異無統計學意義(P>0.05)，但針刺有優于艾灸的趨勢。

表1 針灸對CTX小鼠DNA堿基切除修復基因XRCC1、ADPRT含量的影響

注：與空白組比較:1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討論

環磷酰胺(CTX)是具有細胞毒性的化療藥物，可引起骨髓抑制、外周白細胞減少等一系列不良反應。中醫并無“骨髓抑制”這一病名，根據癥狀表現屬于“虛勞”范疇。《黃帝內經》曰：“正氣存內，邪不可干”“恬淡虛無，真氣從之，精神內守，病安從來”，表明疾病的產生與機體內在的機能狀態密切相關。病機雖復雜，無外乎先后天之本失調與氣血陰陽不和，治療原則當以培補先后天之本為主，兼以補氣調血。選取諸陽之會大椎穴，激發諸陽經之氣，補正氣祛邪氣，調暢經絡之氣使其補而不滯。血會膈俞，取其養血生血、健脾補心之力。取腎臟之氣輸注的腎俞、足陽明胃經的合穴及胃腑的下合穴足三里，共奏培補先后天之本、補脾益腎、調補氣血之功。

XRCC1是X射線交叉互補修復基因1的英文簡稱，是第一個分離出影響細胞對電離輻射敏感性的哺乳動物基因，在廣泛參與化學誘變劑與電離輻射所致 DNA損傷后的單鏈斷裂修復和堿基切除修復過程中扮演著極為重要的角色[7]。XRCC1作為具有橋梁作用的蛋白，共有3個功能域，即位于中間的BRCT-Ⅰ域、XRCC1 C端的BRCT-Ⅱ域和N端的功能域。其中BRCT-Ⅱ域能與DNA連接酶Ⅲ綁定在一起形成復雜的連接體，BRCT-Ⅰ域可與PARP相互作用，N端的功能域與DNA聚合酶β結合，分別參與DNA堿基切除修復及DNA單鏈斷裂修復的過程[8-9]。本研究結果顯示，針灸能顯著提高CTX化療小鼠骨髓細胞DNA中XRCC1的表達含量，揭示其具有促進堿基切除修復能力，改善骨髓抑制的作用。

ADPRT是二磷酸腺苷核糖轉移酶的英文簡稱，是真核細胞中催化聚二磷酸腺苷核糖化的細胞核酶。其通過識別受損斷裂的DNA鏈，且使多種核受體蛋白(包括自身)發生多聚ADP核糖化，從而參與BER過程。當ADPRT迅速結合在DNA斷鏈處時，引發自身多聚核糖化而被激活。被激活的ADPRT與XRCC1共同募集DNA聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ，并使其緊密連接形成復合體，完成DNA損傷修復過程[10]。ADPRT表達下降時，提示在BER過程中，部分DNA損傷未能得到有效修復，受損的DNA增加了基因組的不穩定性與發生突變的頻率，當同時存在其他重要的基因突變或缺失時則導致細胞的癌變[11]。因此保持ADPRT的正常含量，提高堿基切除修復能力，對維持DNA的正常活性尤其重要。

本實驗中，與空白組比較，小鼠腹腔注射CTX后，骨髓細胞DNA中XRCC1、ADPRT含量均明顯降低，經針刺、艾灸治療后，與模型組比較針刺組、艾灸組骨髓細胞DNA中的XRCC1、ADPRT含量均明顯升高。本研究結果揭示，通過針刺和艾灸干預后能夠上調CTX化療小鼠骨髓細胞DNA中，參與BER過程中的核心蛋白XRCC1和ADPRT的表達含量，協同有效地參與堿基切除修復系統，從而提高骨髓細胞DNA堿基切除修復能力，減輕因CTX化療所致骨髓細胞DNA損傷，減輕骨髓抑制，從BER修復系統為針灸抗骨髓抑制闡釋了又一新的分子生物學途徑。