響應面法優化山荊子果實總黃酮的提取工藝

馬智超，翟春梅，懷雪，孟祥瑛，孟永海

(黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

山荊子[Malusbaccata(Linn．) Borkh．]又名山丁子、林荊子，堂梨子等，為薔薇科( Rosaceae) 蘋果屬( Malus) 多年生落葉喬木，主要在我國東北、華北及西南地區分布[1-2]。在抗旱、抗寒、抗病能力方面有較強的表現[3]。作為純野生資源，當地人經常將成熟后的山荊子果實用來泡酒。果實含有豐富的微量元素、萜類、酯類、烯烴類、多酚類物質及黃酮等成分，具有較高的營養價值。據文獻報道，山荊子果實還有抗氧化、抗癌活性、降糖降脂以及保肝等作用[4-7]。山荊子果實不僅可以止瀉、止吐，還可以預防各種如肺結核等的感染性疾病[8]。國外用山荊子果治腸道疾病[9]。近年來，對山荊子果實的研究相對較少，對山荊子葉、莖的文獻報道較為詳盡。由于對山荊子果實中總黃酮的提取工藝知之甚少，所以本文對提取山荊子果實的總黃酮進行探究。為更高效地開發利用野生資源，使天然食品在各領域更好的發揮其作用，增添了理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司生產)；AK2140電子天平(上海奧豪公司)；旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥材

山荊子果實(加格達奇及大興安嶺地產)；蘆丁對照品(批號161008，質量分數≥98%)；氫氧化鈉試液(2 g氫氧化鈉溶于50 mL水中)；5%亞硝酸鈉(5 g亞硝酸鈉溶于100 mL水)；10%硝酸鋁(10 g硝酸鋁溶于100 mL水)；乙醇，以上試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 浸膏的制備

各取50 g山荊子鮮果，按照以下提取方法提取，在相同提取時間內提取相同次數，并將多次提取液合并，濾過，減壓回收乙醇至干，加水溶解，凍干，稱重計算出膏率，待測總黃酮濃度。

2.2 供試品制備

取干浸膏1 g,置100 mL具塞錐形瓶中，加25 mL稀乙醇，超聲處理10 min,轉移至100 mL容量瓶中，加水定容至100 mL。

2.3 對照品制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL含蘆丁0.20 mg的溶液。

2.4 標準曲線繪制

精密量取蘆丁對照品0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00,12.00 mL于具塞試管中，加5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，放置6 min。加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10.00 mL，加水定容至25.00 mL，混勻，放置15 min，以空白溶液為對照，在500 nm波長處測定吸光度(A)。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得標準曲線：Y=11.953X+0.002 4,R2=0.999 5。

2.5 含量測定

精密量取供試品溶液1.00 mL于25.00 mL 比色管中，按“2.4”方法操作，測定提取液的吸光度，由回歸方程計算總黃酮的濃度，山荊子果實中總黃酮的提取率按下式計算:總黃酮提取率(%)= (C×V1×V2)×100/(V3×m)式中，C為樣品中總黃酮質量濃度(mg/mL);V1為提取液的體積(100.00 mL);V2為提取液稀釋后的體積(25.00 mL);V3為量取提取液的體積(1.00 mL);m為山荊子葉的取樣量(mg)。

2.6 提取工藝選擇

基于單因素試驗[10]，將料液比設定為1∶ 25，醇濃度為50%，提取時間為30 min，提取次數為2次，對提取工藝進行選擇。

2.6.1 熱回流提取法

加入以料液比1∶ 25的50%醇，回流提取30 min，提取2次，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至干膏，凍干，計算出膏率，檢測總黃酮含量。

2.6.2 超聲波提取法

加入以料液比1∶ 25的50%醇，40℃，80%超聲波作用條件下，提取30 min，提取2次，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至干膏，凍干，計算出膏率，檢測總黃酮含量。

2.6.3 恒溫提取法

加入以料液比1∶ 25的50%醇，恒溫40℃，提取30 min，50%醇，提取兩次抽濾，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至干膏，凍干，計算出膏率，檢測總黃酮含量。

2.7 響應面法

利用Design-Expert 8.0.6軟件對結果進行數據分析。

3 結果

3.1 提取工藝選擇

由表1可見，以出膏率、總黃酮含量為指標的考察中，熱回流提取方法較其余兩者高，所以響應面法中所使用的提取工藝首選為熱回流提取方法。

表1 不同提取方法提取浸膏的出膏率及總黃酮含量(%)

3.2 響應面法提取工藝結果

按照以下因素水平表(表2)，通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗進行設計與結果統計，見表3，并分析數據結果。

表2 響應面因素及水平

表3 響應面設計方法與結果(%)

3.2.1 響應面法分析結果

通過Design-Expert 8.0.6軟件對以上四個因素數據進行多元回歸擬合。

3.2.2 回歸模型方程

擬合后所得的響應曲面二次多元回歸模型方程為：Y=-32.965 74+2.944 07 A-0.407 74B+2.313 13C-4.442 51D+2.405 07×10-3AB-4.976 21×10-3AC-0.143 50AD-6.667 95×10-3BC+0.286 00BD+0.020 250CD-0.067 828A2-4.576 87×10-4B2-0.029 992C2-1.885 00D2，R2=0.921 6。Y為總黃酮提取率(%)，A、B、C、D分別為料液比、醇濃度、提取時間、提取次數。

3.2.3 檢驗顯著性

對方程的各項進行方差分析，由表4可知，失擬項P=0.756 6不顯著(P>0.05)，則表示模型的擬合度良好。模型P=0.002 2極顯著(P<0.01)。對回歸模型顯著性分析如下：模型一次項C顯著，A、B、D均不顯著。二次項C2、D2極顯著及交互項BD極顯著，且A2顯著，其余均不顯著。根據各因素方差額分析結果顯示，影響響應值的4個因素的順序依次為：提取時間>料液比>醇濃度>提取次數。

3.2.4 因素的交互作用與最優工藝條件

因素交互作用如圖1～6，由Design-Expert 8.0.6預測分析山荊子總黃酮提取的最佳工藝為料液比19.86(g/mL)、醇濃度40%、提取時間32.89 min、提取次數1.28次，預測所得最佳響應值即總黃酮的含量為18.304 9%。為驗證響應面法優化工藝的可靠性，將上述工藝參數稍作修正：料液比1∶ 20(g/mL)、醇濃度40%、提取時間30 min、提取次數1次，實際試驗所得總黃酮量為17.83%，與預測值十分接近，由此可見響應面方法優化工藝利用價值很高，可作為參考指導。

表4 回歸模型的方差分析及顯著性分析結果

注:*P<0.05表示為差異顯著,**P<0.01表示為差異極顯著

圖1 料液比與醇濃度對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(a)與三維圖(b)

圖2 料液比與提取時間對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(c)與三維圖(d)

圖3 料液比與提取次數對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(e)與三維圖(f)

圖4 醇濃度與提取時間對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(g)與三維圖(h)

圖5 醇濃度與提取次數對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(i)與三維圖(j)

圖6 提取時間與提取次數對山荊子總黃酮含量影響的響應面等高線(l)與三維圖(m)

4 討論

響應面優化法(RSM)可以通過對回歸方程的擬合度以及響應面、等高線的繪制,可方便地求出相應于各因素水平的響應值。在各因素水平的響應值的基礎上，可以找出預測的響應最優值以及相應的實驗條件[11-13]。此優化方法的優勢為試驗精度高、試驗次數少、數學模型預測性好等，因而在中藥提取方面受到了廣泛關注[14]。響應面方法更在食品、生物工程以及化工領域受到青睞[15-16]。

RSM有三種常用的實驗設計方法，分別為星點設計(CCD)、Box-Behnken(BBD)與Doehlert(DM)[17]。本實驗所選擇的實驗設計為Box-Behnken(BBD)，由于BBD設計不僅試驗次數少、高效而且還具有使所有的影響因素不同時處于最高水平與所有試驗點都在安全操作區域內的優勢[18]。實驗在單因素考察的基礎上，分別考察了乙醇熱回流、超聲、恒溫浸提三種提取方法[10]。最終發現乙醇熱回流方法不僅出膏率較高而且總黃酮的含量也是最高。通過RSM的分析所得出的最佳工藝為料液比1∶ 20(g/mL)、醇濃度40%、提取時間30 min、提取次數1次，實際實驗所得總黃酮量為17.83%。