參苓白術散對脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠結腸p38MAPK及TNF-α、IL-4的干預作用

賈育新，畢殿勇，段永強，明海霞，萬生芳，程小麗，成映霞，呼會茹

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730020；2.上海中醫藥大學，上海 100006)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis.UC)為一種臨床多見的慢性、復發性疾患，其主要表現為遷延、復發性的腹痛、腹瀉、里急后重，或伴有黏液膿血便等為主要臨床癥狀、體征。

潰瘍性結腸炎主要病理改變多屬累及直、結腸黏膜及黏膜下層的潰瘍性病變，部分重癥病例可發生巨結腸及穿孔等危重并發癥。現代醫學研究觀點認為引起UC的病因尚不十分確切，但機體免疫功能失調被公認為UC的重要發病機制之一。相關研究證實炎癥遞質包括自身相關抗體、細胞因子，氧自由基和一氧化氮、體液免疫及環氧合酶與基質金屬蛋白酶等多個方面在UC的發病中起到重要作用，其中尤以細胞因子及其參與的免疫應激反應已經成為UC發病機制的研究熱點領域[1-2]。

UC歸屬中醫學“腸澼”“泄瀉”“便血”“痢疾”等范疇，中醫學認為脾胃虛弱、濕熱蘊結是本病的基本病機，且在脾胃虛弱的基礎上多伴有濕、熱、痰、瘀血、毒邪等病理產物，故病情遷延難愈。治療原則以健脾和胃，滲濕止瀉為主，兼顧祛除濕熱、毒瘀等邪氣[3]。故本研究選用具有益氣健脾、滲濕止瀉為主要功效的參苓白術散為主要藥物，以期探討本方對UC實驗大鼠結腸組織p38MAPK、IL-4及TNF-α基因及蛋白表達的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，分籠飼養體質量(180±20)g,購自于甘肅中醫藥大學實驗動物中心(合格證編號：62001000000090：SYXK[甘] 2011-0001)；實驗設施證書編號：(SYXK[甘]2011-0001-00000118)。實驗動物飼養條件：雌雄各半分籠飼養, 室內溫度(23±2)℃，濕度45%～55%,給予動物滅菌標準飼料及滅菌純凈水，自由攝食、飲水。

1.2 實驗藥物

實驗中所需中藥飲片均購自于甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房，參苓白術散藥物組成人參 、炒白術、白茯苓、薏苡仁、砂仁、蓮子、桔梗、白扁豆、山藥、陳皮、炙甘草，諸藥配伍比例5∶ 5∶ 5∶ 3∶ 3∶ 3∶ 2∶ 4∶ 2∶ 5∶ 2。藥物煎煮：首次煎煮以相當于藥材量10倍之蒸餾水浸藥2 h，煎煮2次，共計60 min，將兩次所得中藥煎液混合，加熱濃縮至每1 mL含生藥2 g的濃度，室溫冷卻，4℃冰箱貯存。柳氮磺吡啶片購自甘肅中醫藥大學附屬醫院西藥房(SASP，上海信宜天平藥業有限公司，國藥準字H31020557，0.2 g/片)；精煉豬油：安徽徽名山有機農業科技開發有限公司。

1.3 實驗儀器及試劑

三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma公司，批號 SLBK1620V)；TRIzol Reagent (Invitrogen,批號:15596-018)；RT-PCR逆轉錄試劑盒(Promega,批號:0000123564)；RT-PCR實時熒光定量試劑盒(Promega，批號：0000157591)；VELOCITY 18R型高速低溫離心機(伯樂公司，美國)；RT-PCR儀(型號CFX96，伯樂公司，美國)；PCR儀(型號S1000，伯樂公司，美國)；DF110型電子分析天平；PCR所用引物：β-actin(上海生工，批號：9400969792；9400969791)；p38MAPK引物(生工公司，上海，批號9400969796；9400969797)；免疫組化p38MAPK、TNF-α、IL-4的一抗產地(北京博奧森生物技術有限公司p38MAPK Lot:AG07117086S；TNF-α Lot:AG09194335；IL-4 Lot:AG07042938S)；DAB顯色試劑盒(Lot:K176904D北京中杉金橋)；兔SP檢測試劑盒(Lot:K176716K北京中杉金橋)；其他：異丙醇及氯仿等。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

空白組實驗大鼠10只，供給正常飼料、飲水。其余造模組大鼠依據參考文獻[4]復制脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠模型：(1)以復合因素法復制脾虛濕困型UC大鼠模型，即造模單日給予大鼠精煉豬油灌胃(空腹,每只2 mL/d，1次/d)；(2)將實驗大鼠置于于2 cm深的水中8 h/d使其保持站立、游泳狀態；(3)采用隔日禁食、充足飲水的造模方式,連續21 d。(4)以直徑2 mm的硅膠軟管將5%TNBS/50%乙醇的混合藥液灌入實驗大鼠肛門8cm以上部位的結腸。造模后第3天造模大鼠出現腹瀉、黏液膿血便等癥狀，表明脾虛濕困型UC大鼠模型制作成功。根據實驗大鼠的性別不同，按大鼠按體質量編號，以隨機數字表法分組。實驗模型復制成功后，將大鼠分為模型組、參苓白術散治療組(高、中、低劑量治療組)及陽性對照組(柳氮磺胺吡啶組)，每組10只，雌雄分籠飼養，每籠5只。

2.2 藥物干預

空白及模型組實驗大鼠每日以滅菌純凈水空腹灌胃,劑量：10 g/(kg·d)；參苓白術散治療組按實驗設計要求給予藥物干預,高、中、低劑量分別為24 g/(kg·d)、12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)，濃煎液灌胃，每日一次；陽性對照組給予0.2 g/(kg·d)的柳氮磺胺吡啶片劑(單位體質量用藥劑量為60 kg成人用藥量6倍)，以純凈水充分溶解后灌胃。用藥劑量折算以人與動物體型系數為計算標準[5]，各組大鼠灌胃治療均為21 d。

2.3 樣本采集及實驗室檢測

于末次藥物灌胃干預結束后將大鼠禁食24 h，自由飲水。測量記錄各組大鼠體質量，烏拉坦腹腔注射麻醉(劑量：1 g/kg)，將實驗大鼠脫頸處死。截取肛門以上8厘米處的病變結腸組織，生理鹽水反復沖洗干凈，肉眼觀察評分；截取病變部位結腸組織4%多聚甲醛中固定，供病理HE染色和免疫組化檢測使用；取病變最明顯部位的結腸組織置于無酶凍存管內，-80℃冰箱貯存用于后續相關實驗檢測。

2.4 免疫組化法檢測各組實驗大鼠結腸組織內p38MAPK、TNF-α、IL-4的表達水平

取病變部位結腸組織以4%多聚甲醛中固定，供病理和免疫組化檢測使用。采用免疫組化SP法檢測實驗大鼠病變結腸組織內的p38MAPK、TNF-α、IL-4的蛋白含量表達。實驗步驟以實驗p38MAPK、TNF-α、IL-4的試劑盒說明書步驟為準。以胞質(或胞核內)出現淡黃色或棕黃色顆粒為陽性表達標志，每例標本選取物鏡40倍下5個視野進行陽性細胞計數，以出現陽性細胞百分比計算出分值。圖像分析方法：以南京中醫藥大學捷達公司801病理圖像分析系統進行圖像分析，隨機選擇6個視野計算平均光密度值。

2.5 實時熒光定量PCR法檢測大鼠結腸組織樣本p38MAPK、TNF-α、IL-4基因表達

取結腸樣本0.1 g，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA，紫外分光光度計測量RNA濃度(所提取的RNA A260/A280值為1.8～2.0)符合實驗要求，參照逆轉錄試劑盒說明條件合成20 μLcDNA，RT-PCR法擴增。β-actin，批號及引物序列：9400969790,9400969791；上游引物：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA,下游引物：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，產物片段長度150bp；p38MAPK，批號及引物序列：9400969798，9400969799；上游引物：AGACGAATGGAAGAGCCTGA，下游引物：GGGATGGACAGAACAGAAGC，產物片段長度：109bp；TNF-α,批號及引物序列：9400969792,9400969793；上游引物：CAGGTTCCGTCCCTCTCATA，下游引物：TGCCAGTTCCACATCTCG,產物片段長度：100bp；IL-4，批號及引物序列：9400859829、9400859830，上游引物： GAACACCACGGAGAACGAG，下游引物：AGACCGCTGACACCTCTACA；產物片段：112bp。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 實驗大鼠一般生存狀況

與UC造模組大鼠相比較，空白組大鼠活動自如，飲食及二便正常，皮毛正常潤澤；UC造模大鼠在干預后第2天，出現嗜睡瞇眼、毛發干枯、納差等證候，其后出現大便膿血、蜷臥少動等表現。隨造模時間延續大鼠相繼出現納差懶動、形瘦及反應遲緩等體征。經參苓白術散干預治療后，各藥物干預組(尤其高劑量組和柳氮磺氨吡啶組)脾虛濕困型UC大鼠的上述癥狀緩解尤其明顯，主要表現為UC實驗大鼠納食漸增、體重增加、皮毛光滑、潤澤，動作敏捷，大便基本恢復正常形態，各項體征較接近正常水平。

3.2 大鼠結腸組織p38MAPK、IL-4及TNF-αmRNA表達

實驗結果顯示：模型組結腸組織樣本p38MAPK、TNF-α基因表達水平較空白組升高顯著,IL-4mRNA表達水平降低明顯,實驗結果有統計學意義；同模型組相比，高、中劑量的參苓白術散及柳氮磺氨吡啶均可降低大鼠結腸樣本內p38MAPK、TNF-α基因表達水平，同時升高IL-4基因表達水平，P<0.05,P<0.01組間差異具有統計學意義；干預治療后，中高劑量組及西藥對照組IL-4的基因表達水平明顯升高，p38MAPK、TNF-αmRNA表達水平顯著降低，治療效果以陽性對照組及參苓白術散高劑量組最顯著，見表1。

表1 各組大鼠結腸組織p38MAPK、IL-4 、TNF-αmRNA表達水平的比較

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3.3 免疫組化法檢測各組實驗大鼠結腸組織內p38MAPK、TNF-α、IL-4含量比較

同正常組相比，模型組IL-4蛋白的表達量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，西藥組、低組、中組、高組IL-4蛋白的表達量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組、中組IL-4蛋白的表達量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與正常組相比較，模型組p38MAPK蛋白的表達量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，西藥組、低組、中組、高組p38MAPK蛋白的表達量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組、中組p38MAPK蛋白的表達量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與正常組相比較，模型組TNF-α蛋白的表達量明顯增大，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比較，低組TNF-α蛋白的表達量明顯減小，差異顯著(P<0.05)，西藥組、中組、高組TNF-α蛋白的表達量明顯減小，差異極顯著(P<0.01)；與西藥組相比較，低組TNF-α蛋白的表達量明顯增大，差異極顯著(P<0.01),見表2。

表2 各組大鼠結腸組織p38MAPK、IL-4 、TNF-α的含量比較

注：與空白組相比較,**P<0.01;與模型組相比較,#P<0.05,##P<0.01;與西藥組相比較,%%P<0.01

K：空白組； M：模型組D：參苓白術散組6 g/kg；Z：參苓白術散組12 g/kg；G：參苓白術散組 24 g/kg； X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖1 各組實驗大鼠結腸病理切片(HE染色,×100)

K：空白對照；M：模型對照 D：參苓白術散6 g/kg；Z：參苓白術散12 g/kg；G：參苓白術散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖2 參苓白術散對各組脾虛濕困型UC大鼠結腸組織p38MAPK蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

K：空白對照；M：模型對照;D：參苓白術散6 g/kg；Z：參苓白術散12 g/kg；G：參苓白術散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖3 參苓白術散對各組脾虛濕困型UC大鼠結腸組織TNF-α蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

K：空白對照；M：模型對照;D：參苓白術散6 g/kg；Z：參苓白術散12 g/kg；G：參苓白術散24 g/kg；X：柳氮磺胺吡啶0.2 g/kg圖4 參苓白術散對各組脾虛濕困型UC大鼠結腸組織IL-4蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

4 討論

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis.UC)屬于一種非特異性結腸潰瘍性炎病變，又可歸屬于炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)范疇。本病發病機制復雜，病因機制尚不十分明確，其病變范圍局限于結腸組織黏膜及黏膜下層。本病以腹瀉、黏液膿血便及里急后重等癥為主要臨床表現，故當歸屬于中醫學泄瀉、痢疾、大瘕泄等范疇[6]。中醫治療本病多采用健脾益氣、滲濕止瀉及疏肝理氣等法，代表方劑如參苓白術散、痛瀉要方等多獲良好療效[7-8]。本研究通過復制脾虛濕困型UC大鼠并施以藥物干預，以期探討具有健脾益氣、滲濕止瀉功效的參苓白術散對該型UC大鼠結腸黏膜組織細胞因子p38MAPK、TNF-α基因、蛋白表達的干預效果，以期闡明參苓白術散對UC的作用機制。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的重要成員之一，其介導細胞內信號轉導作用在細胞增殖、分化、凋亡、組織炎癥病變等生理和病理過程中具有重要作用。Li等的實驗研究表明[11]，姜黃素可通過阻斷p38MPAK信號通路，抑制前炎性細胞因子(TNF-α、 IL-6)等的釋放，從而減輕結腸黏膜組織的白細胞浸潤。其他研究證明[12]香草乙酮可以通過阻斷NOXs-ROS-p38MAPK細胞信號通路，減輕中性粒細胞浸潤，有效治療葡聚糖硫酸鈉(DSS)所導致的實驗小鼠的結腸炎性病變,所有這些研究從側面證實p38MAPK細胞信號通路與UC的發生、發展之間具有密切的聯系。

腫瘤壞死因子(TNFα)是一種主要由巨噬細胞和單核細胞所產生的促炎因子，其生物學功效為參與正常炎性反應及免疫性病理損傷，在許多病理狀態下TNF -α的表達異常增多。臨床研究表明[13-14]，實驗性結腸炎模型小鼠DSS結腸組織內TNF-α濃度較正常小鼠體內表達水平明顯升高，且TNF-α濃度的變化與疾病的嚴重程度、炎癥遷延復發呈正相關。此外，UC實驗模型[15]大鼠常伴肺、腸組織中TNF-α、TLR4、MIF、Mad CAM-1mRNA 等的含量表達明顯高，故可以確定TNF-α參與了UC的病變過程。

實驗結果分析：模型組大鼠較空白組的一般生存情況較差，其結腸組織內p38MAPK、TNF-αmRNA及其蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。其結腸組織IL-4mRNA及其蛋白表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。表明p38MAPK、TNF-α表達水平升高、IL-4分泌水平降低和脾虛濕困型UC發生、發展存在密切關系。造模因素可引起實驗大鼠結腸黏膜組織炎癥因子p38MAPK、TNF-αmRNA及其蛋白表達水平顯著升高，IL-4mRNA及其蛋白表達水平明顯減少，進一步損傷、降低UC大鼠結腸黏膜對炎性細胞因子的免疫防御機能。同模型組比，參苓白術散中、高治療組與SASP組UC大鼠的生存狀況改善較顯著，結腸黏膜組織內炎癥因子p38MAPK、TNF-α基因及蛋白含量表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，尤以參苓白術散高劑量組作用顯著，提示參苓白術散可通過阻斷p38MAPK信號通路，降低TNF-α的基因表達及蛋白表達水平，升高IL-4的基因表達及蛋白表達水平，進而改善脾虛濕困型UC模型大鼠結腸黏膜對促炎癥因子的防御機能，抑制結腸黏膜細胞凋亡進展，從而促進UC模型實驗大鼠結腸黏膜組織的炎癥修復。