肉桂醛脂質體對3種水產動物致病菌抑菌效果比較

康昌源，王慶奎，王靜波，馮俊超

(1.天津農學院水產學院，天津300384;2.北京市水產技術推廣站，北京300380)

副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌在海水環境中廣泛存在，是海水養殖魚類常見的致病菌［1－3］，其中遲緩愛德華氏菌和副溶血弧菌還是人畜共患菌。目前，對這幾種致病菌引起的水產動物相關疾病的防治還主要依賴傳統的化學消毒劑、抗生素等［4－5］。這些藥物雖然在動物病害防控方面見效快、效果好，但由于會使致病菌產生耐藥性以及污染水環境等明顯缺陷，開發安全高效的新產品或新方法已成為水產疾病防控的熱點。中草藥因其毒副作用小、易降解等特點已成為水產抗病防病的重要研究方向［6］。

肉桂醛(cinnamaldehyde)別稱桂皮醛、桂醛，是樟科植物肉桂的干皮及樹皮經水蒸氣蒸餾得到的揮發油(肉桂油)中的主要成分，分子式為C6H5=CH CHCHO，在室溫下為淡黃色油狀物，難溶于水、甘油，易溶于乙醇、乙醚中［7］。肉桂醛具有在動物體內代謝快、無殘留、對養殖環境無污染、病原菌對其不易產生耐藥性等優點，被認為是一種新型的綠色、環境友好型飼料添加劑［8－9］。美國食品和藥物管理局(FDA)認為，肉桂醛是一種安全的食品添加劑［10］。研究發現，肉桂醛對許多細菌、真菌都具有抑殺作用［11－12］，不僅能脅迫殺傷動物體內的致病性大腸桿菌［13］，還能作為防腐劑抑殺食源性致病菌［14］。肉桂醛難溶于水的特性使其無法直接在水體中應用。將肉桂醛制成脂質體后，可極大提高其在水體中的分散性。目前，肉桂醛脂質體(liposome－encapsulated cinnamaldehyde，LEC)在水產養殖中的研究很少，僅有的1篇研究發現用LEC藥浴攻毒無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和創傷弧菌(Vibrio vulnificus)后的斑馬魚(Danio rerio)能顯著提高斑馬魚的存活率，并能顯著降低攻毒魚體內的菌落數［15］。本試驗比較LEC對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌的體外抑菌效果，為肉桂醛在水產動物疾病防控中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:試驗所用副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌由本試驗室提供。

主要試劑:蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、肉桂醛(95%)、無水乙醇，均購自日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 營養肉湯 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，121℃下高壓滅菌15 min，冷卻后用于培養遲緩愛德華氏菌;培養哈氏弧菌和副溶血弧菌的液體培養基在此基礎上多加10 g海水晶。營養瓊脂:在營養肉湯的基礎上添加20 g的瓊脂粉。經活化培養后的菌液用相應的肉湯稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 肉桂醛脂質體(LEC) 參照 Faikoh的方法［15］，配比稍有改動，將40 mg/mL肉桂醛(95%)、體積分數為7%的液體大豆卵磷脂、體積分數0.5%的維生素E溶解于5%乙醇中，在磁力加熱攪拌器(Hg－4A)攪拌混勻，混合物用超高壓均質機(JN－10C)處理(壓力為400 bar，流速為10 L/h)3次，獲得肉桂醛脂質化包埋產物LEC。制備空白脂質體(LE)時，用等量的5%乙醇替代肉桂醛。

1.2.3 濾紙片制備 選取吸水性好的優質濾紙(由杭州富陽北木漿紙有限公司提供，型號102)若干，用打孔器打成直徑為6 mm的圓形濾紙片，高溫高壓滅菌后備用。

1.2.4 抑菌圈測定 在潔凈工作臺(SW－CJ－ZFD)里進行操作，將肉桂醛與50%乙醇1∶3稀釋后作為第1個濃度，然后用50%乙醇不斷2倍稀釋構成共計5個濃度，每個濾紙片上完全吸收5μL相應濃度的藥液。吸取0.1 mL的菌懸液，用涂抹棒均勻涂布在相應的瓊脂培養基表面，用無菌鑷子夾取含有不同濃度肉桂醛溶液的濾紙片，貼在含菌平板上，每個梯度作3個濾紙片。于28℃恒溫培養箱中培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，每個抑菌圈在2個垂直方向上測量2次，取平均值。抑菌效果等級劃分參照文獻［16］:抑菌直徑＜8 mm為無抑菌作用;8～10 mm為弱抑菌作用;11～15 mm為中等抑菌作用;≥16 mm為強抑菌作用。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)試驗［17］采用2倍稀釋法，先將肉桂醛與50%乙醇1∶3稀釋，構成工作液。將工作液不斷2倍稀釋形成共10個梯度用于抑菌研究。取稀釋液0.1 mL加入到裝有0.8 mL液體培養基的試管中，再接入0.1 mL含菌量為108CFU/mL試驗菌的菌懸液，于28℃培養24 h后，從各管取出0.1 mL，分別涂布平板，繼續培養24 h后，觀察有無細菌生長，若有菌落生長，記為陽性(+)，若無菌落生長，記為陰性(－);以無細菌生長的肉桂醛最低濃度為MIC。以添加0.1 mL 50%乙醇不添加肉桂醛成分為陰性對照，以不添加50%乙醇和肉桂醛成分的培養基為空白對照，每種處理作3個平行。

LEC的MIC研究則將LEC作為工作液，用滅菌生理鹽水2倍稀釋共7個濃度作用于3種致病菌。以添加空白脂質體(LE)作為陰性對照，以添加滅菌生理鹽水作為空白對照。其他處理同肉桂醛的抑菌操作。

1.2.6 最小殺菌濃度(MBC)試驗［18］在 MIC的基礎上，從無菌生長的試管中取0.1 mL培養液加入到10 mL液體培養基中，混勻，28℃繼續培養24 h，再用平板涂布法觀察有無細菌生長，無菌生長的最小濃度即為MBC。對照組同MIC試驗，每種處理作3個平行。

2 結果與分析

2.1 肉桂醛和LEC的抑菌直徑

由圖1可知，肉桂醛和LEC對所選的3種菌均有明顯的抑制效果，隨著肉桂醛濃度增大，抑菌圈直徑逐漸增大，抑菌效果更加明顯。遲緩愛德華氏菌的抑菌直徑比另2種菌的抑菌直徑在相同肉桂醛濃度下表現更為明顯，副溶血弧菌的抑菌直徑范圍在3種菌中跨幅最小。進一步分析可知，在肉桂醛組中，濃度為15.62 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌無抑菌作用，而對哈氏弧菌為弱抑菌作用，對遲緩愛德華氏菌則為中等抑菌作用。肉桂醛濃度為31.25 mg/mL時對副溶血弧菌為弱抑菌作用，而對哈氏為中等抑菌作用，對遲緩愛德華氏菌則為強抑菌作用。濃度為62.50 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌表現為中等抑菌作用，而對另2種菌則表現為強抑菌作用。肉桂醛濃度在125.00、250.00 mg/mL時對3種菌都表現出強抑菌作用。

在LEC組中，肉桂醛濃度為2.50、5.00 mg/mL時對遲緩愛德華氏菌為弱抑菌作用，對副溶血弧菌和哈氏弧菌均無抑菌作用。濃度為10.00 mg/mL的肉桂醛對副溶血弧菌和哈氏弧菌為弱抑菌作用，濃度為20.00 mg/mL時對這2種菌均為中等抑菌作用;而遲緩愛德華氏菌在這2個肉桂醛濃度下均表現為中等抑菌作用。當肉桂醛濃度在40.00 mg/mL時，肉桂醛對3種菌都表現為強抑菌作用。

2.2 MIC

由表1可知，肉桂醛組 MIC結果中，肉桂醛濃度為7.81 mg/mL時，副溶血弧菌和哈氏弧菌不生長;肉桂醛濃度為1.95 mg/mL時，遲緩愛德華氏菌不生長。說明肉桂醛對副溶血弧菌和哈氏弧菌的最小抑菌濃度為7.81 mg/mL，對遲緩愛德華氏菌的最小抑菌濃度為1.95 mg/mL。

LEC組的 MIC結果(表 2)顯示，肉桂醛濃度為2.50 mg/mL時，副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌不生長;肉桂醛濃度為1.25 mg/mL時，哈氏弧菌不生長。說明LEC中肉桂醛對副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌的最小抑菌濃度為2.50 mg/mL，對哈氏弧菌的最小抑菌濃度為1.25 mg/mL。

2.3 MBC

肉桂醛和LEC均能殺滅副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌。由圖2可知，肉桂醛組中，3種菌對肉桂醛的耐受性不同，哈氏弧菌耐受性最強，最小殺菌濃度為15.62 mg/mL;其次是副溶血弧菌，最小殺菌濃度為7.81 mg/mL;敏感性相對最強的是遲緩愛德華氏菌，最小殺菌濃度為1.95 mg/mL。在LEC試驗組中，肉桂醛對3種菌的最小殺菌濃度均為5 mg/mL。

表1 肉桂醛對3種菌的MIC

表2 LEC對3種菌的MIC

3 討論與結論

將肉桂醛經包埋、均質處理制成的脂質體(LEC)，具有易溶于水的優良特性。本試驗中，LEC對3種致病菌都有顯著的抑菌、殺菌作用，這為肉桂醛在水體中的應用提供了有益借鑒，擴大了肉桂醛的應用前景。

研究表明，天然植物精油對生產中的許多致病菌都有很好的抑制作用。本試驗中肉桂醛對3種革蘭氏陰性菌都有抑制作用，這與王帆等對大腸桿菌和綠膿桿菌這2種陰性菌的抑菌結果［19］一致。本試驗抑菌直徑結果表明，肉桂醛的抑菌效果與其濃度呈正相關，隨著濃度的增大，肉桂醛對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌抑菌能力越來越強。研究認為肉桂醛的抑菌作用是由于其具有一定的疏水性，可穿透細胞壁，與細胞膜相互作用，使細胞膜的透過性增強［20］。本研究發現，不同受試菌對肉桂醛和LEC敏感性不同，副溶血弧菌在相同肉桂醛濃度下抑菌直徑相對較小。與肉桂醛相比，LEC能使肉桂醛在更低濃度下即能表現出顯著的抑菌效果。

對比LCE和肉桂醛的MIC和MBC結果可知，相較于遲緩愛德華氏菌而言，副溶血弧菌和哈氏弧菌對LEC表現出更高的敏感性，這可能與弧菌屬和愛德華菌屬的生物構成差異有關，其抑菌機理有待進一步研究。

LEC和肉桂醛對副溶血弧菌、哈氏弧菌和遲緩愛德華氏菌均有明顯的抑菌、殺菌作用，且隨著用藥濃度的增大，抑菌能力增強。LEC在水體致病菌的防控中具有良好的開發應用前景。