連作對設施番茄土壤微生物及酶活性的影響

李蘭君，劉玳含，劉建斌，武鳳霞，朱英波

(1.河北科技師范學院生命科技學院，河北秦皇島066600;2.北京市農林科學院植物營養與資源研究所，北京100097;3.北京城市學院城市建設學部，北京100083)

進入20世紀90年代，隨著溫室大棚、地膜覆蓋等技術的發展，設施農業隨之迅速發展［1］，設施蔬菜已經成為我國蔬菜生產的重要組成部分。近年來，由于人均耕地的減少、經濟需要等原因，設施菜地的復種指數、集約化程度的增加使得設施菜地連作現象十分普遍。隨著連作年限的增加，出現設施蔬菜產量降低、病蟲害加劇等現象。連作障礙已經成為限制設施蔬菜高產、穩產的主要因素［2－3］。

長期連作破壞土壤穩定性，設施菜地中普遍存在土壤肥力下降、土壤次生鹽漬化及土壤酸化［4－6］，嚴重影響植物對水肥的吸收利用，影響植物生長發育。吳道銘等對南方酸性紅壤的研究表明，長期種植單一作物破壞土壤結構及土壤通透性，使土壤水鹽失衡進而加劇土壤酸化及鋁毒現象［7］。番茄連作的研究表明，連作使得土壤質量下降，土壤養分失衡，對土壤有機質、土壤全氮、速效鉀、速效磷等都有很大影響［8－9］。土壤微生物是生態系統的重要一環，在土壤物質循環能量流動中具有不可替代的作用［10－11］。土壤微生物群落結構及土壤酶活性是土壤生態系統中最活躍的部分，能敏感地反映出土壤的質量和狀態，是評價土壤環境的重要指標［12－13］。大量研究表明，土壤連作障礙與微生物的關系密切［14－16］。長期連作使土壤微生物生態環境失衡［17－18］。隨著連作年限的增加，土壤細菌數量下降而土壤真菌數量上升［19］，真菌與細菌比值上升，土壤由肥力高的細菌型轉變為肥力低的真菌型。Mazzola研究表明連作病害多來自真菌［20］。馬寧寧等對設施番茄的研究表明，連作使土壤可培養微生物的種類下降，部分土著微生物滅絕［21］。馬海燕等對非洲菊的研究表明，脲酶含量隨連作年限的增加先增加后下降［22］。土壤中過氧化氫酶活性隨番茄連坐年限增加緩慢增加而后逐漸下降，也有研究表明土壤過氧化氫酶活性隨著連作年限的增加而上升［23］。本研究對北京市房山區的設施番茄連作土壤進行了理化指標、微生物指標和酶活性指標的綜合分析，明確了不同指標的變化規律及指標之間的相關性，以期為設施連作土壤的改良提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年12月在北京市房山地區的設施蔬菜大棚選取番茄連作土壤作為試驗土壤樣品，共10個試驗區，設施蔬菜的連作年限分別為 0、1、3、5、6、7、8、9、10、20 年。取得樣品后當天帶回實驗室，一部分樣品在于4℃保存，用于微生物測定;一部分土壤樣品在陰涼處風干，撿出植物殘體、石塊及其他雜物。將風干后土壤樣品碾碎，通過1 mm及0.25 mm篩子的土壤樣品備用。

1.2 土壤理化性質的測定

土壤有機質含量測定采用K2Cr2O7氧化－外加熱法，全氮含量測定采用凱氏定氮法，速效鉀含量測定采用NH4OAc浸提－火焰光度法，有效磷含量測定采用NaHCO3浸提－鉬銻抗比色法，電導率使用電導率儀測定，pH值使用pH儀測定，水 ∶土 =5 ∶1［24］。

1.3 微生物純培養試驗及DNA提取方法

土壤微生物數量采用稀釋平板法測定，細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基培養2～3 d后計數，真菌采用PDA培養基培養3～5 d后計數。

土壤細菌、真菌DNA分別使用細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、真菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取，細菌16S rDNA擴增，引物為27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和1492R(5'－TACGGCTACCTTCGACTT-3')，真菌ITSrDNA擴增，引物為ITS1(5'－TCCGTAGGTGAAGCGG－3')和ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')［25］。擴增后的PCR產物由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序分析。

1.4 土壤酶活性測定方法

土壤過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法測定，以1 g土消耗的0.1 mol/L KMnO4的體積(mL)表示。土壤脲酶活性采用比色法測定，以3 h后1 g土含有的的量(mg)表示［25］。

1.5 數據分析

采用SPSS 22.0軟件對數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 連作年限對設施番茄土壤理化性質的影響

研究發現，隨著連作年限的增加，設施番茄土壤的全氮、速效鉀、有效磷含量均逐漸增高然后下降，分別在連作7年、7年、6年達到最高值，比未連作土壤增加幅度分別達87.50%、751.93%、497.09%(表1)。其中土壤全氮含量在連作20年與未連作土壤相比差異不顯著，其他連作年限全氮含量顯著高于未連作土壤，土壤速效鉀、有效磷含量皆顯著高于未連作土壤。土壤有機質含量變化趨勢與土壤的全氮、速效鉀、有效磷含量變化趨勢類似，在連作6年達到最高值，比未連作土壤增加幅度達到122.45%。由此可見，在連作過程中土壤有機質、全氮、速效鉀、有效磷處于先積累后消耗的狀態。

隨著連作年限的增加，土壤pH值顯著下降，在連作8年達到最低值，較未連作土壤下降了0.7，在連作20年土壤pH值有所恢復。隨著連作年限的增加，土壤電導率先上升后下降，在連作5年達到最大值，較未連作土壤增加幅度達到8.34%，連作1年到連作6年與未連作土壤差異不顯著，連作7年到連作20年土壤電導率顯著低于未連作土壤。

2.2 連作年限對可培養土壤微生物的影響

2.2.1 連作年限對設施番茄土壤可培養土壤微生物數量的影響 研究發現，隨著連作年限的增加，設施番茄土壤細菌數量呈先上升后下降趨勢(圖1)。在連作6年達到最高值，增加幅度為1 566.67%，連作8年后，細菌數量穩定，與未連作土壤差異不顯著。真菌數量變化趨勢類似于細菌變化趨勢，在連作7年達到最高值，增加幅度為1 209.09%，連作6年與連作7年真菌數量差異不顯著;連作9年后真菌數量趨于穩定，與未連作土壤差異不顯著。設施番茄土壤微生物總量變化趨勢類似于細菌、真菌變化趨勢，隨著連作年限的增加設施番茄土壤微生物總量呈先上升后下降趨勢，在連作6年達到最高值(圖2)。土壤中細菌數量最多，細菌是土壤可培養微生物的優勢群體，但隨著土壤連作年限增加，土壤細菌/真菌一直降低，在連作8年達到最低值，連作9年后土壤細菌/真菌開始上升，與連作8年土壤細菌/真菌差異顯著，與未連作土壤差異不顯著(圖3)。

表1 連作年限對設施番茄土壤理化性質的影響

2.2.2 連作年限對設施番茄土壤可培養土壤微生物種類的影響 隨著番茄連作年限增加，土壤可培養微生物的種類也發生了很大的變化(表2)。土壤可培養真菌的種類隨連作年限的增加而緩慢減少，連作前6年真菌種類基本是不變的，連作7年后真菌種類開始減少。土壤可培養細菌種類連作前6年逐漸增加，其中連作3年開始出現微桿菌屬(Microbacterium sp.)、溶桿菌屬(Lysobacter sp.)(表 3)。連作 6、7、8、9、10 年均檢測到寡養假單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)。連作7年后土壤可培養細菌種類開始減少，一些土壤細菌開始消失，其中連作1年出現的堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)，在連作10、20年都沒有發現;地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)存在于連作3～8年，連作9、10、20年均未發現該菌。

表2 連作年限對設施番茄土壤可培養真菌種類的影響

2.3 連作年限對設施番茄土壤酶活性的影響

土壤酶廣泛參與土壤中各種生物化學過程，其活性反應了土壤養分轉化能力及土壤微生物的活性。其中過氧化氫酶參與土壤中各種化合物的氧化反應，并且能促進過氧化物的分解，避免其對植物的毒害作用。脲酶直接參與土壤中的氮循環，能在一定程度上反映土壤的供氮能力。隨著連作年限的增加，設施番茄土壤過氧化氫酶活性先增加后下降，在連作6年達到最高值，增加幅度為19.18%，連作6、7年過氧化氫酶活性顯著高于未連作土壤，連作20年過氧化氫酶活性顯著低于未連作土壤，其他連作年限過氧化氫酶活性與未連作土壤差異不顯著(圖4)。隨著連作年限的增加，設施番茄土壤脲酶活性先顯著上升后顯著下降，在連作5年達到最高值，增加幅度為27.03%，連作3、5、6年脲酶活性顯著高于未連作土壤，連作7年后脲酶活性顯著低于未連作土壤，連作9、10、20年之間脲酶活性差異不顯著(圖5)。

2.4 連作番茄土壤理化性質、酶活性、微生物數量相關性分析

研究發現，土壤脲酶活性與土壤電導率相關系數最大，為0.935(表4)。土壤過氧化氫酶活性與土壤全氮含量、有機質含量相關性較大，相關系數分別為0.804、0.828，說明土壤全氮含量、有機質含量較高時，土壤過氧化氫酶活性隨之增加。土壤細菌數量、真菌數量與土壤有機質含量相關系數都較高，分別達到0.759、0.925，土壤有機質含量較高時，適于土壤真菌、細菌的生長。土壤有效磷含量與土壤真菌數量、細菌數量相關系數為0.753、0.659，土壤速效鉀含量與土壤真菌數量、細菌數量相關系數為0.760、0.303。真菌數量和細菌數量均與有機質含量的相關性最大。

表3 連作年限對設施番茄土壤可培養細菌種類的影響

3 討論與結論

長期連作條件下，土壤理化性質、土壤微生物總量、微生物多樣性、土壤酶活性都會改變，從而影響作物生長發育，降低作物產量。土壤微生物是植物根際最活躍的部分，能敏感地反映出土壤生態系統的變化［12－13，26－27］。本試驗結果表明，隨連作年限增加，土壤細菌、真菌數量呈先增加后降低趨勢，細菌與真菌比值則一直降低甚至連作7年后低于未連作土壤，土壤由細菌型向真菌型轉變，這與前人研究結果［28－30］一致。此外，連作前期可培養真菌種類較為穩定，連作7年后可培養真菌種類減少，連作9、10年僅有2種可培養真菌。連作9、10、20 年均未發現木霉屬(Trichoderma sp.)真菌，而目前發現的生防菌多為木霉屬真菌，并且在此之前多屬真菌漸漸消失。可培養細菌種類隨連作年限先上升后下降，連作10僅有4種可培養細菌，連作7年后芽孢桿菌種類減少，連作3年后開始出現微桿菌，連作6年后開始出現寡養假單胞桿菌，芽孢桿菌被證實對植物生長有促進作用［31－32］，為根際有益微生物，其他多屬細菌逐漸消失，總體細菌多樣性減少。因此，長期連作使土壤環境趨向單一化，對土壤微生物進行定向選擇，土壤有益菌減少，有害菌增加。

表4 連作番茄土壤理化性質與酶活性、微生物數量相關系數

土壤中酶來源于土壤微生物和根際分泌物，可以催化土壤中有機質的轉化，其中過氧化氫酶可以分解腐殖質形成過程中產生的過氧化氫，減少其對植物的傷害，脲酶能促進土壤中有機氮向無機氮轉化，提高土壤的供氮能力［26］。本試驗結果表明，土壤過氧化氫酶活性隨連作年限先增加后下降，總體變化不明顯，僅有連作20年土壤過氧化氫酶活性低于未連作土壤。脲酶活性變化明顯，連作前5年增加，之后開始迅速降低，連作7年低未連作土壤。

受溫室大棚過量施肥、肥料利用率低及得不到雨水充分淋洗等條件影響，設施菜地土壤的有機質、全氮、速效鉀、有效磷水平普遍較高［33－34］，且均高于露天土壤。本試驗結果表明，連作前期土壤有機質、全氮、速效鉀、有效磷水平隨連作年限增加均升高，并且全氮與速效鉀水平在連作7年到達最大值，有機質和速效磷水平在連作6年達到最大值，而后開始降低。pH值隨連作年限增加不斷降低，一直處于6.50～7.50間，土壤屬于中性土。電導率先隨連作年限的增加而升高，連作5年達到最大值，連作7年后降低幅度較大，與有機質、全氮、速效鉀、有效磷變化趨勢類似。但根據全國土壤養分分級標準(6級制)，設施番茄土壤各連作年限有機質含量都達到3級，其中連作6、7年達到1級;土壤全氮含量都達到3級，其中連作5、6、7、8年達到1級;土壤速效鉀、有效磷含量都達到1級。說明設施番茄施肥量非常充足，甚至已經過量。

由番茄連作土壤理化性質、酶活性、微生物數量相關性分析得出，土壤脲酶活性與電導率相關極顯著，土壤過氧化氫酶活性與土壤全氮含量、有機質含量相關性極顯著。土壤真菌數量、細菌數量分別與土壤有機質含量相關極顯著、顯著。土壤脲酶活性受土壤電導率影響較大，土壤微生物數量受土壤有機質含量影響較大。

本試驗結果表明，長期連作條件下，土壤細菌與真菌的比值一直下降，土壤由細菌型轉向真菌型，連作前期土壤微生物多樣性、酶活性、土壤養分均處于一個較高水平，土壤生態環境良好。連作6、7年后土壤微生物多樣性降低，土壤微生物數量降低，酶活性減少，土壤養分減少，土壤質量下降，土壤生態環境轉向惡劣，出現普遍的連作障礙問題。因此，在設施番茄生產中應盡量避免連作，對于長期連作的番茄產區可以通過與其他作物間作、調節pH值、合理施肥、施用微生物菌劑等方法防治連作障礙。