BHMT和RFC1多態性與中國北方漢族兒童神經管缺陷的易感性研究

王懿征，舒劍波，方玉蓮，蔡春泉

隨著醫療技術的進步，我國圍生兒死亡率呈現出明顯下降的趨勢，但由于先天畸形造成的圍生兒死亡在圍生兒總死亡中的比例明顯攀升［1］。神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是一組高發的中樞神經系統先天畸形，由胚胎發育早期神經管閉合不完全引起，包括無腦畸形、脊柱裂、腦膜腦膨出和脊髓脊膜膨出等［2］。我國每年約有8～10萬名NTDs患兒出生［3］，給患兒家庭及社會帶來了巨大的精神壓力和經濟負擔。NTDs是一種多因素疾病，由遺傳和環境因素共同作用導致，發病機制尚未明確。有關研究表明，孕婦血漿中低葉酸水平與高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平是NTDs發生的危險因素［4］，且圍孕期婦女補充葉酸可以防止約50%～75%NTDs的發生［5］，但其潛在的保護機制尚不清楚。因此，研究者們開始關注影響葉酸及Hcy代謝、轉運的相關基因。同時，隨著人類基因組計劃的完成，人們愈來愈相信基因組中單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）有助于解釋個體的表型、對疾病易感性及對環境因子耐受性的差異。本研究選取與葉酸代謝相關的甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉移酶基因（betaine-homocysteine methyltransferase，BHMT）和還原葉酸載體1基因（reduced folate carrier 1，RFC1，又稱SLC19A1）的9個SNPs位點進行研究，以了解BHMT和RFC1基因多態性與中國北方漢族兒童NTDs易感性的關聯。

Tab.1 The information of candidate SNPs表1 候選SNPs位點信息

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年11月—2014年5月天津市兒童醫院神經外科確診的NTDs患兒152例（病例組），其中男87例，女65例，年齡2 d～11歲，中位年齡5.45（3.44，7.93）歲。其中，脊髓脊膜膨出48例，腦膜膨出32例，顯性脊柱裂20例，隱性脊柱裂52例。選取同期顱腦外傷的患兒169例為對照組，其中男90例，女79例，年齡1～12歲，中位年齡6.15（2.74，9.36）歲，排除NTDs、先天性心臟病、智力低下等出生缺陷。入組研究對象均為長期居住在中國華北、西北及東北地區的漢族人群，且所有母親在妊娠期間均補充葉酸。2組年齡（t=0.283，P=0.777）、性別（χ2=0.513，P=0.474）差異無統計學意義。樣本的采集獲得天津市兒童醫院醫學倫理委員會的批準，并獲得患兒監護人的知情同意。

1.2 基因組DNA提取 收集研究對象的外周血標本2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。采用BIOMIGA公司生產的gDNA mini kit從外周血中提取基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA的濃度與純度，置于-80℃儲存備用。

1.3 候選SNPs的選擇 參考相關文獻［6-7］，選取葉酸及Hcy代謝通路中2個關鍵酶基因BHMT和RFC1。利用Haploview 4.2軟件在HapMap數據庫（HapMap Data Rel 27phaseⅡ+Ⅲ）中搜索并篩選SNPs位點。條件如下：中國北京漢族人群（CHB），Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗P值（HWpval）＞0.05，最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）≥0.05。隨后，結合dbSNP數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）以及SNP功能預測網站（FuncPre，http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm）對上一步篩選出的標簽SNPs進行進一步分析，盡量選擇有潛在功能的SNPs位點，見表1。

1.4 基因分型 所有樣本的基因分型由基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術的Sequenom Mass-ARRAY系統完成，分型結果錄入Filemaker Pro數據庫進行整理。

1.5 連鎖不平衡及單體型分析 根據2個基因不同的SNPs位點在染色體上的相對位置，采用Haploview（http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview）軟件，使用Four Gamete Rule原則定義單體型塊得到相應連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）圖，依據LD分析所確定的單體型塊，在SHEsis在線分析平臺下對NTDs兒童以及正常兒童的SNPs單體型進行分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析，檢測2組基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡，以檢驗樣本的群體代表性。病例組和對照組間等位基因和基因型分布的比較采用χ2檢驗，以優勢比（OR）及其95%CI評估等位基因和基因型發生頻率在不同組間發生NTDs的風險。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 對照組SNPs位點（BHTM，rs7700970）的基因型頻率不符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=4.351，P=0.037），因此未參與后續的數據分析。其余各SNPs位點均符合此平衡（P＞0.05），并參與后續數據分析。

2.2 不同的SNPs與NTDs的關系 通過對樣本2個基因中8個SNPs位點進行分析，得到3個SNPs位點與NTDs的易感性相關（P＜0.05），分別為BHMT基因rs3733890和RFC1基因rs1051266、rs3788200。其余5個SNPs位點在本次試驗中未發現與NTDs易感性相關（P＞0.05）。BHMT基因rs3733890位點，攜帶A等位基因的兒童患NTDs的風險是攜帶G等位基因者的1.408倍，見表2。RFC1基因rs1051266位點，攜帶G等位基因和GG基因型的兒童患NTDs的風險分別是攜帶A等位基因和AA基因型者的1.492倍和2.020倍，見表3。RFC1基因rs3788200位點，攜帶G等位基因的兒童患NTDs的風險是攜帶A等位基因者的1.368倍，見表4。

Tab.2 Genotype and allele frequency of BHMT(rs3733890)in two groups表2 2組兒童BHMT基因rs3733890位點在等位基因與基因型頻率分布 ［例（%）］

Tab.3 Genotype and allele frequency of RFC1(rs1051266)in two groups表3 2組兒童RFC1基因rs1051266位點在等位基因與基因型頻率分布 ［例（%）］

Tab.4 Genotype and allele frequency of RFC1(rs3788200)in two groups表4 2組兒童RFC1基因rs3788200位點在等位基因與基因型頻率分布 ［例（%）］

2.3 不同基因單體型分析及與NTDs的關系 采用Haploview軟件得到2個基因的連鎖不平衡分析圖，見圖1。頻率低于0.03的單體型以及不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡的位點均未納入統計，結果顯示BHMT基因單體型C-A-A-A和C-G-A-A（rs567754-rs3733890-rs558133-rs585800）在2組間的分布差異有統計學意義（P＜0.01）。其中C-A-AA單體型OR（95%CI）為2.145（1.337～3.440），提示其可能使NTDs發生風險增加，而C-G-A-A單體型的OR（95%CI）為0.516（0.353～0.753），提示其可能使NTDs發生風險降低。同樣，RFC1基因的單體型G-GG-T（rs1051296-rs3788200-rs1051266-rs4819130）可能使NTDs發生風險增加，見表5。

Fig.1 LD plot maps of BHMT and RFC1圖1 BHMT和RFC1基因連鎖不平衡分析圖

Tab.5 Haplotype analysis results of BHMT and RFC1表5 BHMT和RFC1基因單體型分析結果 ［例（%）］

3 討論

NTDs是一組多因素的復雜性疾病，一般認為由環境因素和遺傳因素共同導致。環境因素包括母親孕早期接觸放射線、化學物質（如多環芳烴類［8］、汞、鉛和砷等重金屬［9］）、農藥［10］等可增加NTDs的發生率。而遺傳學方面已發現DNA甲基化［11-12］、平面細胞極性（PCP）信號通路［13］、葉酸及Hcy代謝通路等［10,14］相關基因多態性與NTDs易感性相關。其中葉酸及Hcy代謝通路的關鍵酶主要包括BHMT、亞甲基四氫葉酸脫氫酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD）、甲硫氨酸合成酶（methionine synthetase，MTR）、甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase，MTRR）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）和胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）等［6-7］。單體型是位于一條染色體特定區域的一組相互關聯、并傾向于以整體遺傳給后代的SNPs的組合，又稱單倍體型或單元型。本研究發現BHMT與RFC1兩基因的SNPs位點與NTDs易感性相關。同時，通過對單倍體進行分析，亦發現其與NTDs的發生相關。

3.1BHMT多態性與NTDs易感性的關系BHMT是一種遺傳修飾因子，是體內重要的Hcy甲基轉移酶，在調控血漿Hcy濃度的過程中扮演了非常重要的角色。由于BHMT基因突變或相關營養物質攝入不足往往導致Hcy水平升高，而研究表明葉酸缺乏與Hcy水平升高有關［15］。BHMT基因rs3733890位點（c.716G＞A）突變導致編碼的精氨酸變為谷氨酰胺（p.Arg239Gln）。Boyles等［16］發現該位點的多態性與美國白人NTDs易感性有關。但也有報道其與NTDs易感性無關［17］。本研究亦發現該位點攜帶A等位基因可使中國北方漢族兒童發生NTDs風險增加。同時單體型研究顯示，單體型C-A-A-A可使NTDs發生風險增加，而單體型C-G-A-A可使NTDs發生風險降低。

3.2RFC1多態性與NTDs易感性的關系RFC基因在小腸組織中表達為葉酸載體，對葉酸的轉運起著重要作用。葉酸在小腸吸收的過程主要通過RFC途徑完成［18］。RFC1基因rs1051266位點發生突變（c.80A＞G）會導致編碼的組氨酸變為精氨酸，可能改變其代謝途徑，影響細胞內葉酸的利用率，進而調控葉酸代謝。Patrizia等［19］發現該位點突變（c.80A＞G）與意大利人群NTDs易感性相關。Etheredge等［20］亦發現該位點突變增加中國人群脊髓脊膜膨出的易感性。另外一項研究指出攜帶GG/GA基因型的孕母在孕初期發熱可增加NTDs的發生風險［21］。本研究亦發現在中國北方漢族兒童中該位點攜帶G等位基因和GG基因型使發生NTDs風險增加。RFC1基因rs3788200位點C等位基因在2組間分布具有統計學意義，表明其與NTDs的發病存在明顯關聯。一項關于高加索人和西班牙裔墨西哥人的研究表明rs3788200位點多態性與脊髓脊膜膨出易感性存在顯著相關［22］，與本研究結果一致。此外，本研究中單體型分析結果提示RFC1基因的單體型G-G-G-T可使NTDs發生風險增加。

綜上所述，本研究發現BHMT基因rs3733890，RFC1基因rs1051266、rs3788200多態性與中國北方漢族兒童NTDs易感性密切相關。今后，本課題組將進一步研究來闡明BHMT和RFC1基因多態性對NTDs影響的機制。