缺乏維生素D受體激活及CYP27B1代謝調控在心腎綜合征中的作用

王蕾，孫鳳姣，李旭

天然維生素D（vitamin D，VitD）包括Vit D2和Vit D3，均無生物活性，必須在體內經過連續的轉化才能成為活性VitD分子，即1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］。腎臟近曲小管上皮細胞的25-羥基維生素D-1α-羥化酶（CYP27B1）是VitD代謝過程中的關鍵酶，可催化25-羥基維生素D3［25（OH）D3］轉化為1，25（OH）2D3，從而調節循環血液中活性VitD水平［1-3］。活性VitD主要通過與維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）結合發揮其生物學效應。VDR除了在腎臟表達外，還廣泛表達于心血管系統［4］。近年來發現，VitD和VDR激活缺乏不僅與腎臟疾病的發生發展關系密切，而且對心血管系統疾病也有重要影響［5］，可能成為治療心腎綜合征（cardiorenal syndrome，CRS）的潛在靶點。本文主要就VDR和CYP27B1的代謝調控在CRS中的研究進展作簡要綜述。

1 VDR的生物學特征

1.1 VDR的分布和類型VDR是介導活性VitD發揮生物效應的生物大分子，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族中的一員，廣泛分布于體內各組織細胞中，在傳統的靶器官，如腸道、腎臟、骨骼分布最多。另外，心血管系統的主要細胞類型中均有一定的表達，如血管平滑肌細胞、內皮細胞、心肌細胞、多種免疫細胞和血小板［4］。

VDR由膜受體（membrane VDR，mVDR）和核受體（nuclear VDR，nVDR）兩大類組成。1，25（OH）2D3由VDR誘導結合血漿內維生素D結合蛋白（vitamin D binding protein，BDP），循環到不同的靶組織，從而通過“基因組”和“非基因組”兩種方式來介導其內分泌的功能［6-8］。活性Vit D與mVDR結合后，能在極短的時間內迅速引發下游信號轉導事件，屬于非基因組效應，主要發揮經典的鈣磷調節作用；而nVDR本質上是一種配體依賴性的核轉錄因子，其與DNA反應元件相互作用產生基因效應，參與調節細胞增殖、分化、凋亡、氧化應激、膜轉運、細胞外基質穩態、細胞黏附及免疫調節等非鈣磷調節作用［4］。

1.2 VDR的分子結構 人類VDR基因位于第12號染色體上，長度大于100 kb。由8個外顯子以及至少6個內含子組成［1，5］。VDR分子由427個氨基酸組成，依據氨基酸N端到C端的序列可分為A～F六個功能區，依次為A/B區（轉錄激活功能區，包含激活功能結構域，activation function，AF-1），C區（DBD區，DNA binding domain），D區（鉸鏈區，hinge region），E/F區（LBD區，ligand binding domain，該區包含有AF-2），每個功能區分工不同但又相互協作［9-10］。其中，N端高度保守的DBD區和C端可變的LBD區是VDR的兩個核心功能結構域，兩者由鉸鏈區進行銜接［9-11］。DBD區為DNA結合區，包含兩個鋅指結構，每個鋅離子與4個半胱氨酸殘基構成四面體結構，其中殘基參與識別靶基因上的維生素D反應元件（vitamin D response elements，VDREs）。LBD區為配體結合區，由12個α-螺旋（α helices，H1-H12，AF2對應于H12）和3個β折疊（β sheets，S1-S3）組成，主要包含配體結合口袋和二聚體形成區域。1，25（OH）2D3與核內nVDR結合后，使nVDR磷酸化并發生構象改變后吸引核內維甲類X受體（retinoid X receptor，RXR），形成VDR-RXR異二聚體，進而與靶基因上游啟動子區的VDREs相互作用，從而引起各種相應的生物學效應［11］。

1.3 VitD生物活性的檢測 目前，VitD的體外活性檢測方法主要包括高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS）、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、化學發光免疫測定法（CIA）、單熒光實時定量PCR和雙重實時熒光定量PCR等［12-13］。相比較而言，在體外細胞水平上，熒光素酶報告基因技術可更直觀地監測細胞內1，25（OH）2D3與基因表達有關的信號級聯。然而，細胞轉染時對目的基因片段進行擴增會增加其與轉錄因子的結合效率，所獲得的生物活性往往比實際要高。而在生理狀態下，由于染色質高級結構的存在，這段DNA很可能并不與其相對應的轉錄因子相結合，是沒有功能的［14］。另外，VDREs存在眾多可變序列和VDR親和力譜，這種可變性使得采用單一傳統生物學方法已經很難真實地反映VDREs的轉錄活性［14］。近年來發展的染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunopreciptation assay，ChIP）與芯片（chip，microarray）或測序（sequencing）相結合的ChIP-chip和ChIP-seq技術能在全基因組范圍內識別生理狀態下某個DNA結合蛋白與DNA序列的結合位點，從而反映體內真實的基因表達調控情況［11，15］。Pike等［11］采用ChIP-chip技術確定了1，25（OH）2D3誘導1，25-二羥維生素D3-24-羥化酶（CYP24A1）基因表達的轉錄活性受多個增強子的影響，這些增強子無方向性，不僅位于啟動子近端，并且位于啟動子遠端和CYP24A1基因下游區域，均可通過啟動子來增加轉錄活性。Meyer等［2］研究表明1，25（OH）2D3抑制CYP27B1基因表達，并進一步采用ChIP-seq方法確定了轉錄因子結合的啟動子區域，而1，25（OH）2D3調控CYP27B1基因的轉錄模式表現為腎臟組織特異性，在腎外來源細胞未觀察到類似的調控模式。相比而言，ChIP-chip和ChIP-seq技術可以找出1，25（OH）2D3調控不同靶基因啟動子區的DNA序列結合位點，并結合計算生物學技術推測這個過程中起關鍵作用的轉錄因子，為預防與1，25（OH）2D3相關的各種疾病提供了依據。

2 CYP27B1在VitD代謝通路中的作用

人類的CYP27B1基因含有9個外顯子，長度大于5 kb。CYP27B1由細胞色素P450、鐵硫蛋白（又稱鐵氧還蛋白）和黃素蛋白（又稱鐵氧還蛋白還原酶）3個成員組成，主要存在于腎臟近曲小管上皮細胞線粒體中［1］。CYP27B1將25（OH）D3C-1位羥基化形成1，25（OH）2D3，其是VitD在體內的活化形式。實驗研究表明，CYP27B1基因突變失活或敲除小鼠能夠誘發Ⅰ型維生素D依賴性佝僂病（vitamin D dependency rickets type 1，VDDRⅠ，也被稱作假性維生素D缺乏性佝僂病）。與此同時，給予充足VitD喂養的小鼠仍然表現出血清1，25（OH）2D3缺乏、低血鈣和繼發性甲狀旁腺功能亢進癥（secondary hyperparathyroidism，SHPT），提示CYP27B1對于維持循環血液中活性VitD水平具有重要作用［1-2，16］。

CYP27B1主要在腎臟以及孕期胎盤表達，此外皮膚、免疫系統等腎外區域中也存在少量表達。如在干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和脂多糖（lipopoly?saccharides，LPS）的免疫刺激下，巨噬細胞活化誘導CYP27B1基因上調，從而促進1，25（OH）2D3生成，而血清1，25（OH）2D3升高對巨噬細胞CYP27B1表達無影響［1］。此外，癌細胞、甲狀旁腺等也可檢測到CYP27B1表達。然而，除腎臟和胎盤以外，體內其他部位CYP27B1的表達及活性在正常生理狀態下對相應部位功能是否有影響仍需進一步確認。

CYP27B1的表達受到多種因素的調節，包括鈣離子水平、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和1，25（OH）2D3［1-2］。低鈣血癥引起PTH升高能夠誘導腎臟組織中CYP27B1轉錄，導致1，25（OH）2D3生成增多，而1，25（OH）2D3升高反過來又抑制CYP27B1的表達。除了鈣離子水平、PTH和1，25（OH）2D3外，成纖維細胞生長因子23（fibroblast growth factor 23，FGF-23）也參與了CYP27B1基因表達的調控。在腎臟組織中，FGF-23可高度抑制CYP27B1基 因 的表達［17］，從而減少循環1，25（OH）2D3水平。Meyer等［2］發現，上述因素對CYP27B1基因的轉錄模式調控選擇性存在于腎臟組織，而在腎外來源的細胞可能存在其他調控方式。

Fig.1 The role of CYP27B1 and VitD/VDR in the cardiorenal syndrome圖1CYP27B1、VitD和VDR在心腎綜合征中的作用

3 VitD/VDR及CYP27B1與CRS

3.1 VitD/VDR與慢性腎臟病 慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）中普遍存在VitD缺乏，隨著病情的加重，并發VDR減少及敏感性減低，即導致VitD抵抗［5，17］。導致VitD缺乏的原因如下［5，18-19］：首先是由于腎體積的減小、磷酸鹽潴留、腎功能障礙，特別是腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）下降至60 mL/min時導致腎臟1α-羥化酶活性降低；其次，25（OH）D3被催化轉化為代謝失活產物24，25（OH）2D3增多，而還原產物1，25（OH）2D3減少；再者，近年來研究報道血清FGF-23濃度在CKD進展的早期即升高，FGF-23可高度抑制CYP27B1基因的表達［17］，使得1，25（OH）2D3生成減少。總之，上述多種因素共同造成了CYP27B1活性降低，進而導致循環中內源性1，25（OH）2D3的產生受限（見圖1）。而腎外其他組織合成對于循環1，25（OH）2D3的水平影響甚小。1，25（OH）2D3減少又可刺激甲狀旁腺細胞分泌PTH增多，而PTH升高反過來又抑制CYP27B1基因的表達，繼而導致1，25（OH）2D3合成障礙，形成惡性循環。此外，腎臟本身作為VitD的主要靶器官，VitD缺乏及其受體抵抗不僅導致鈣磷代謝紊亂及骨營養不良，且加速腎小球纖維化及腎小管硬化，進而加重腎臟病的進展。

目前，活性VitD相關制劑帕立骨化醇（paricalcitol）和度骨化醇（doxercalciferol）已被批準用于治療CKD相關的SHPT。與傳統制劑相比，該類VitD類似物可選擇性地降低血清PTH水平，因而不影響鈣磷吸收，無升高血鈣的不良反應［1］。Han等［20］通過Meta分析證實paricalcitol能有效抑制未透析CKD患者的PTH分泌，也能顯著減少糖尿病CKD患者蛋白尿水平，該研究進一步指出paricalcitol治療組患者鈣磷代謝產物顯著升高且具有高鈣血癥的發展趨勢，提示應用paricalcitol的患者預后存在血管鈣化的風險。因此，臨床CKD患者使用VitD活性制劑的早期生化指標的變化，包括PTH、鈣、磷、25（OH）D3和1，25（OH）2D3水平只能反映療效的一個側面，還應該在前瞻性隨機對照試驗中關注長期的預后過渡指標（如血管鈣化、骨密度和組織學）以及終點指標（心血管疾病、死亡率和骨折等）來反映療效的全面性［1］。

3.2 VitD/VDR與心血管疾病VitD與分布于心血管系統VDR結合，可調控與細胞的增殖、分化、凋亡、氧化應激、膜轉運、細胞外基質穩態和細胞黏附相關基因的表達，通過多通路的調節來減少心血管疾病的發生率和死亡率［4］。研究表明，VitD可以通過調節其他信號通路，如腎素、一氧化氮（NO）信號等，參與心血管疾病的發生發展。一方面，VitD缺乏可以激活腎素-血管緊張素內分泌系統，該信號系統在調控外周血管阻力方面起重要作用。當誘導VDR或CYP27B1敲除時，小鼠血清腎素和血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）水平顯著升高，誘導高血壓和心臟肥大［21-22］。另一方面，血鈣正常的VDR缺失小鼠表現出血管內皮功能障礙，其機制與NO合成酶表達減少、造成NO的生物利用度降低有關［23］。通過特異性敲除內皮細胞VDR，發現內皮型NO合酶（NOS）表達減少，引起舒張功能受損，導致內皮功能障礙［24］，且這種作用機制不依賴于腎素-血管緊張素系統的改變。此外，VDR缺失小鼠可表現出血栓前狀態，其機制與抗凝血酶和血栓調節蛋白生成減少有關［25］。研究顯示，VDR激動劑能改善CKD大鼠心功能并減少心肌纖維化［26］，也可拮抗高鹽飲食大鼠心肌肥厚［27］，而心肌特異性敲除VDR小鼠表現出左室肥厚［28］。這些結果進一步證明VDR激動劑可通過多信號多環節調控對心血管系統疾病起到保護作用。

臨床流行病學研究也證實了VitD缺乏與心血管疾病的危險因素，如高血壓、胰島素抵抗、代謝綜合征、糖尿病等密切相關。Vit D低水平狀態可觸發炎性級聯反應，誘導內皮功能障礙，促進動脈硬化，從而增加患心血管系統疾病的風險。然而，最近的隨機對照試驗研究顯示，VitD對心血管疾病危險因素的影響不一致，尚不能確定補充VitD與心血管事件下降之間的關系［1］。因此，通過補充VitD以降低人群患心血管疾病風險的方法尚未納入常規療法。

3.3 CYP27B1、VitD和VDR與CRS心血管疾病和腎臟病常合并存在并相互影響，互為因果，這兩者共存的狀態稱為CRS［5，29］。CRS的病理生理學機制錯綜復雜，迄今尚未完全闡明。目前普遍認可的機制主要包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renninangiotensin-aldosterone system，RAAS）過度激活、炎癥反應、NO/活性氧（NO/ROS）失衡、交感神經系統（SNS）過度興奮及貧血等方面［5］。然而目前針對相關的信號通路所采取的干預措施并不能完全緩解CRS。這提示可能還存在其他機制參與了CRS的病理生理調控。

近年來研究發現，1，25（OH）2D3/VDR信號途徑也參與了CRS的病理生理調控［5］。循環中90%以上的內源性1，25（OH）2D3必須經由腎臟CYP27B1的羥化作用而產生。CRS時，腎功能進行性損傷導致腎小管上皮細胞1α-羥化酶活性降低，1，25（OH）2D3生成減少，并繼發VDR減少。由于VitD/VDR信號的心臟保護作用遭到破壞，誘發如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等心血管危險因素發生，導致心血管疾病的發生率增加，從而加重CRS的進展。

腎組織CYP27B1基因的轉錄調控模式與腎外其他組織不同［2］，這使得選擇性激活腎臟CYP27B1表達成為可能。腎臟CYP27B1表達上調后，1α-羥化酶活性增強，從而使循環血液中活性VitD水平升高。1，25（OH）2D3再與腎臟和心血管受體廣泛作用，對CRS發揮間接保護作用。因此，CYP27B1和VDR可能成為聯系腎臟和心臟疾病的重要靶點，即腎臟選擇性CYP27B1激動劑可能成為治療CRS的極具潛力的新型藥物。在中醫藥研究領域，已證實具有補腎活血作用的藥方在調節VDR環節起到確切作用。筆者課題組前期研究表明，冠脈通片全方有明顯升高1，25（OH）2D3效果，同時對CYP27B1和VDR蛋白表達均有增加作用，冠脈通片通過促進CYP27B1表達，升高循環1，25（OH）2D3水平，從而間接或直接激活VDR的表達，是其對腎陽虛心肌梗死模型大鼠產生心腎保護作用的機制［30］。最新研究表明，淫羊藿苷可提高D-半乳糖致衰老大鼠腎臟CYP27B1和VDR的mRNA表達水平，提示淫羊藿苷抗衰老作用與增高VitD活性有關［31］。

流行病學調查顯示，VitD缺乏與CKD患者的心血管疾病發病率和死亡率密切相關［32-33］。CKD患者應用VitD補充劑（主要為Vit D3）能延緩病情進展并提高生存率［33］。然而，旨在闡明VitD補充劑在心臟保護方面作用的前瞻性研究尚未取得統一的結論。近年來一項來自婦女健康倡議的研究指出，絕經后婦女采用VitD聯合鈣劑進行治療不能降低心肌梗死和冠心病的致死風險［33］。另有研究表明，CKD患者口服paricalcitol后，左心室質量指數并未減少［34］，但左心房容積和腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）的水平顯著降低［35］。盡管如此，已有大量臨床研究證實VitD補充劑可降低CKD患者心腎共同損傷標志物——尿蛋白的含量，結果提示進一步探究VitD作為RAAS阻斷劑的補充療法治療CRS具有重要意義［33］。

4 小結

目前，CRS仍然是醫學界待攻克的難關。VitD/VDR信號與CRS的發生發展關系密切。目前，臨床已經應用VitD補充療法及其類似物治療CRS，對延緩CRS的進展、降低CRS的死亡率具有重要意義［5］。CYP27B1是活性VitD產生的代謝調控關鍵酶，也是CRS發生發展過程中病理生理學機制的關鍵點。近年來研究發現，腎組織CYP27B1基因的轉錄調控模式與腎外其他組織不同［2］，這種組織特異性的基因調控模式使得選擇性激活腎臟CYP27B1基因表達成為可能，是具有重大研究價值和發展潛力的藥物靶點，尤其對CRS患者，但仍需更多的基礎研究及臨床試驗進一步證實。