美拉德反應對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響

劉婕，姜竹茂，劉曉，單靜，艾春梅

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺，264005）

0 引 言

羊奶業是我國奶業的重要組成部分，是部分地區經濟發展的重要支柱產業[1]。羊奶被稱為“奶中之王”，營養組成和功能作用與母乳相接近，具有獨特的生物活性性質，乳脂肪球和酪蛋白膠粒較小，更易于人體消化吸收，可作為牛乳治療營養不良兒童的最佳替代品[2-3]。褐色乳酸菌飲料是一種風味獨特、口感清爽的乳飲料，是脫脂牛乳與還原糖在高溫殺菌的過程中發生了一定程度的美拉德反應而呈現褐色，再經用干酪乳桿菌或其他益生菌長時間發酵、破乳、調配、均質、灌裝等而制成的一種發酵型乳酸菌飲料[4-5]。益生菌是一類能對人和動物產生有益作用，可以改善腸道微生物平衡，促進腸道健康，從而提高宿主的免疫調節功能[6-9]。目前我國羊奶產品較為單一，主要以傳統的液態羊奶為主。鑒于褐色乳酸菌飲料市場需求，將羊奶的營養功能和益生菌的保健功能相結合，開發出具有保健功能的褐色益生菌羊乳飲料具有重要意義。

美拉德反應是游離氨基酸、多肽或蛋白質的氨基與還原糖的羰基之間發生的一種復雜反應，其反應產物包括揮發性香氣物質、Strecker醛類物質和大分子質量棕黑色聚合物，這些產物在食品風味的形成中起著重要作用[10]，是廣泛存在于食品工業的一種非酶褐變。美拉德反會產生各種特殊的風味物質，形成特殊的焦糖風味和色澤，同時還具有抗氧化等特點[11-14]。發生美拉德反應的過程十分復雜，其反應受到還原糖種類、氨基化合物、溫度、時間、p H、水分、金屬離子等多重因素的影響[15-16]，因此美拉德反應的程度對產品的品質有很大的影響。但是在美拉德反應過程中會損失蛋白質和氨基酸，甚至反應條件控制不當可能會產生有害有毒物質，比如，蛋白非酶糖基化會產生一種棕黃色的美拉德反應末端產物AGEs，這種物質會增加炎癥，誘導氧化應激反應，可以造成糖尿病并發癥的發生與發展[17-19]。因此本實驗主要研究了羊乳與不同的還原糖在不同溫度、不同加熱時間下美拉德反應的程度，通過響應面設計試驗選擇出最佳的美拉德反應條件，為褐色益生菌羊乳飲料的研究與發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純羊奶，市售；葡萄糖、果糖，西王藥業有限公司；果葡糖漿，山東香馳健源生物科技有限公司；白砂糖，市售；干酪乳桿菌，潤盈生物（上海）有限公司；檸檬酸鈉，山東檸檬生化有限公司；穩定劑，丹尼斯克（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 加工工藝

1.3.2 操作要點

（1）褐色發酵基料的制備：純羊奶脫脂后，加入一定量的還原糖，60℃攪拌15 min使其充分溶解，經60℃、20 MPa均質后，置于95～98℃水浴中進行褐變殺菌120～180 min，降溫至36～38℃，添加4%干酪乳桿菌，混勻后發酵70～72 h，待發酵酸度達到180°T時終止發酵，冷卻后，4℃冷藏10～12 h，備用。

（2）褐色益生菌羊乳飲料的制備：用70～80℃凈化水溶解穩定劑與白砂糖，高速攪拌使其充分溶解，95℃、15 min殺菌后冷卻至30℃，與褐色發酵基料混合。用檸檬酸鈉將其pH值調整至3.6～3.8，酸度控制在60～68°T，調酸調香后經20 MPa、25℃均質，再經113℃、5 s殺菌，灌裝，2～6℃冷藏，即得成品。

1.3.3 單因素試驗

選擇葡萄糖、果糖、果葡糖漿三種還原糖，考察它們對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響，通過黃藍值和感官評價確定最佳的還原糖；進而考察還原糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%）、褐變溫度（86℃、89℃、92℃、95℃、98℃）、褐變時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）等三個因素對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響，并進行感官評價和測定其黃藍值。

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1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，利用Box-Behnken組合試驗設計原理[20-21]，選擇果糖添加量、褐變溫度、褐變時間為影響因素，以黃藍值、感官評價為評價指標，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行處理，確定最佳的褐變工藝條件。試驗因素和水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.3.5 評價指標

（1）黃藍值的測定

美拉德反應產物呈現黃褐色，是食品風味的主要來源之一。測定褐色益生菌羊乳飲料樣品的黃藍值可以表示產品中黃褐色產物的相對濃度，進而比較產品的美拉德反應程度。樣品黃藍值越高，美拉德反應相對越充分，產品的風味越濃郁[22]。

（2）感官評價

隨機選自10名食品專業人員對產品進行評定，對褐色益生菌羊乳飲料按表2評定標準進行感官評定[23-24]。

表2 褐色益生菌羊乳飲料感官評價標準

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 還原糖種類的確定

糖是美拉德反應重要的影響因素之一，糖的種類和結構不同會產生不同的反應速度，同時也產生不同的風味物質和色澤[25]。本研究選擇了常見的三種還原糖（葡萄糖、果糖、果葡糖漿）進行美拉德反應。由圖1可知，還原糖的種類對褐色益生菌羊乳飲料的品質和色澤影響較大。果糖的感官評分最高，果葡糖漿次之，葡萄糖最差。果糖的黃藍值也最高，顏色的變化也最大，即美拉德反應程度最強，果葡糖漿次之。由于果糖溶解度高，溫度越低，甜度越大的特點，更適合于褐色益生菌羊乳飲料，所以選擇果糖作為最佳還原糖來進行美拉德反應。

2.1.2 還原糖添加量的確定

美拉德反應主要在羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質）之間發生縮合、脫水、降解、聚合等一系列的反應[26]，因此還原糖的添加量對風味物質的產生有重要的影響。由圖2可知，隨著果糖添加量的增加，褐色益生菌羊乳飲料的感官評分呈現先上升后下降的趨勢，當果糖添加量為10%時，感官評分最高，當果糖添加量超過10%時，產品口感偏甜，焦糖風味濃郁，掩蓋了產品原有的奶香味，感官評分下降。同時當果糖添加量為10%時，黃藍值最大，美拉德反應程度最大，但是果糖添加量超過10%時，黃藍值下降，可能由于果糖濃度的增大，果糖分子之間的碰撞幾率增大，引起焦糖化反應程度增加，進而使美拉德反應程度下降，導致黃藍值減小，因此選擇果糖添加量為10%為最佳果糖添加量。

2.1.3 褐變溫度的確定

美拉德反應受溫度的影響很大，溫度相差10℃，褐變速度相差3～5倍[27]。由圖3可知，在選定的溫度范圍內，褐色益生菌羊乳飲料的感官評分先上升后下降的趨勢，當溫度為95℃時，感官評分最高，呈現棕褐色，焦香風味明顯，溫度低于92℃，美拉德反應程度較低，產物特征香味不明顯；當溫度高于95℃時，感官評分下降，可能是因為美拉德反應程度較大，類黑精物質生成較多，掩蓋了原有的風味[28-29]。同時，隨著溫度的升高，產品的黃藍值增大，美拉德反應程度增大。考慮經濟成本和節約能源，因此選擇95℃為美拉德反應溫度。

2.1.4 褐變時間的確定

反應時間是影響美拉德反應的重要因素之一，通常反應時間與美拉德反應程度成正比。由表4可知，隨著時間的延長，褐色益生菌羊乳飲料的感官評分呈現上升后平穩的趨勢，當褐變時間為150 min時，焦香風味充足，但在褐變時間180 min時，產品伴有淡淡的苦香味。同時，產品的黃藍值隨著褐變時間的延長而增大，即美拉德反應程度逐漸增大，當褐變時間超過150 min時，產品基本呈現褐色。考慮到經濟成本和節約能源，因此選擇150 min為最佳褐變時間。

圖1 不同還原糖對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響

圖2 果糖添加量對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響

圖3 褐變溫度對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響

圖4 褐變時間對褐色益生菌羊乳飲料品質的影響

2.2 響應面法優化美拉德反應條件

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果及Box-Behnken中心組合設計原理，以果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時間（C）作為3因素，以黃藍值和感官評分為響應值，進行響應面優化試驗。試驗設計方案及數據結果如表2所示，對表2中數據進行方差分析，結果如表3和表4。

利用Design-Expert軟件對表3試驗數據進行多元回歸方程擬合，建立以黃藍值對果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時間（C）的擬合方程為Y1=11.11+0.26A+1.37B+1.28C+0.015AB+-0.15BC-0.58A2+0.91B2+0.37C2。

由表4可知，當模型F=311.00時，P＜0.0001，說明模型是極顯著的。當失擬項F=2.20時，P=0.2311＞0.05，說明模型失擬項不顯著。決定系數R2=0.9975，校正系數R2Adj=0.9943，表明黃藍值的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，表明該模型能夠很好的對褐色益生菌羊乳飲料的黃藍值進行分析和預測。

通過方差分析，該模型中的一次項A、B、C與二次項A2、B2、C2表現為極顯著，交互項BC表現為顯著，交互項AB、AC對黃藍值影響不顯著，表明實驗中褐變溫度、褐變時間都對褐色益生菌羊乳飲料的黃藍值具有較大影響。由3個因素F值大小可以推斷影響褐色益生菌羊乳飲料品質的各因素主次順序為：B＞C＞A，即褐變溫度＞褐變時間＞果糖添加量。

利用Design-Expert軟件對表3試驗數據進行多元回歸方程擬合，建立以感官評分對果糖添加量（A）、褐變溫度（B）、褐變時間（C）的擬合方程為Y1=77.60+0.75A+4.00B+3.25C+0.25AB+0.25AC+0.25BC-1.43A2+3.07B2-0.92C2。

表3 響應面試驗設計及結果

表4 黃藍值方差分析表

由表5可知，當模型F=36.47時，P＜0.0001，說明模型是極顯著的。當失擬項F=1.04時，P=0.4649＞0.05，說明模型失擬項不顯著。決定系數R2=0.9791，校正系數R2Adj=0.9943，表明感官評分的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，表明該模型能夠很好的對褐色益生菌羊乳飲料的感官評分進行分析和預測。

通過方差分析，該模型中的一次項B、C與二次項B2對感官評分影響極顯著，二次項A2、C2對感官評分影響顯著，交互項AB、AC、BC對感官評分影響不顯著，表明實驗中褐變溫度、褐變時間都對褐色益生菌羊乳飲料的感官評分具有較大影響。由3個因素F值大小可以推斷影響褐色益生菌羊乳飲料品質的各因素主次順序為：B＞C＞A，即褐變溫度＞褐變時間＞果糖添加量。

表5 感官評分方差分析表

2.2.2 響應面分析

為了考察各個交互項對褐色益生菌羊乳飲料黃藍值、感官評分的影響，利用Design-Expert軟件對回歸方程進行運算，作出交互項的三維響應面圖及等高線圖如圖5、圖6所示，能比較直觀的解釋各個變量和變量之間的對響應值的影響。通過Design-Expert對建立的回歸方程進行參數優化分析，可得到黃藍值最高，感官評分最高時最佳褐變工藝條件，即果糖添加量11.35%、褐變溫度97℃、褐變時間180 min。在此條件下褐色益生菌羊乳飲料的黃藍值為14.3345，感官評分為86.352。

2.2.3 驗證試驗

利用Design-Expert軟件進行回歸模型預測褐色益生菌羊乳飲料的最佳褐變工藝方案為果糖添加量11.35%、褐變溫度97℃、褐變時間180 min。為了檢驗該回歸模型預測的可靠性，同時考慮到實際生產操作，將最佳褐變工藝方案更改為果糖添加量11%、褐變溫度97℃、褐變時間180 min。在該條件下重復三次試驗，得到產品的平均黃藍值為14.12，平均感官評分為86.7，黃藍值的相對誤差為1.49%，感官評分的相對誤差為0.40%，與預測值基本一致，說明該模型擬合度較好，能夠較好的預測實際情況。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面法建立了多元回歸模型，確定了褐色益生菌羊乳飲料的最佳褐變工藝條件，即確定的最佳褐變工藝條件為：果糖添加量11%、褐變溫度97℃、褐變時間180 min。在此條件下的驗證試驗中褐色益生菌羊乳飲料的平均黃藍值為14.12，平均感官評分為86.7，與預測值基本一致，此時美拉德反應狀態良好，使褐色益生菌羊乳飲料色澤呈現黃褐色，焦糖風味突出，口感細膩清爽，符合對生產飲料的要求，可以應用到中試生產中。

圖5 各因素交互作用對黃藍值的響應面和等高線圖

圖6 各因素交互作用對感官評分的響應面和等高線圖