酪蛋白糖巨肽（GMP）的研究進展

李委紅，劉會平，孫娜新，陳沛，劉少娟，劉旭輝

（食品營養與安全國家重點實驗室，教育部食品營養與安全重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

0 引 言

乳制品是優質蛋白質的良好來源，其消化率遠高于植物蛋白質，牛乳中的蛋白質質量分數為3%～4%，其中80%以上為酪蛋白。Waugh等[1]于1956年發現了酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質，即κ-酪蛋白。隨后Delfour等[2]發現，凝乳酶能特異性水解牛乳κ-酪蛋白中苯丙氨酸105-蛋氨酸106的酰胺鍵，生成不溶性的副κ-酪蛋白（1～105部分）和三氯乙酸（TCA）可溶性的酪蛋白糖巨肽（106～169部分）。副κ-酪蛋白存在于凝乳中，溶解于乳清中的GMP則一同被排出，因此乳清粉是GMP的重要原料。

酪蛋白糖巨肽（Casein glycomacropeptide，GMP或CGMP）是一種含有唾液酸（Sialic acid，SA）的活性糖基磷酸肽，其多樣化的生物功能活性主要與肽鏈上糖基和磷酸基團的不同有關[3]。目前，人們對GMP的分離純化方法及抗感染、抗炎、調節腸道微生物菌群等生物活性進行了較為深入的研究。

1 GMP的結構及特點

在牛乳GMP的11種遺傳變異型中，以A、B型最為重要，兩者的區別在于第136位和第148位氨基酸種類不同，A型為蘇氨酸136和天冬氨酸148，而B型為異亮氨酸136和丙氨酸148[4]。GMP主鏈上的絲氨酸127,149為磷酸化位點，5種糖基（見表1）通過O-糖苷鍵與絲氨酸或蘇氨酸共價連接，且糖鏈中富含SA[3-5]。

表1 GMP的糖鏈組成

酪蛋白糖巨肽幾乎不含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，含有較多的支鏈氨基酸（如纈氨酸和亮氨酸），可用于苯丙酮酸尿癥患者（不能代謝芳香族氨基酸）和肝臟病患者的膳食中和修飾蛋白濃縮物[6-7]。GMP無二級結構，p I較低，親水性比其他乳清蛋白高，在酸性條件下含有凈負電荷，且具有熱穩定性和可溶性。GMP含有大量具有生理活性的SA，且其復雜的糖肽結構賦予GMP多樣化的生理功能性。

2 GMP的制備及分析方法

2.1 GMP的制備

乳清粉和牛乳酪蛋白是制備GMP的重要原料，相比酪蛋白，乳清粉在分離純化前無需酶解，研究者們更青睞于以乳清粉為原料來獲得GMP。

2.1.1 沉淀法

沉淀法主要包括冷乙醇沉淀、(NH4)2SO4沉淀和TCA沉淀，利用GMP的熱穩定性和沉淀法可從乳清粉中獲得GMP。Rojas E等[8]對乳清粉進行90℃熱處理，沉淀離心后的產品平均回收率為34.08%；吳疆[9]分別利用TCA和硫酸銨二次沉淀分離得到GMP，硫酸銨沉淀法得到的GMP純度為85.07%。

2.1.2 層析法

層析法主要包括離子交換法、凝膠過濾色譜、親和層析和疏水色譜等，可獲得產品純度及SA含量均較高的GMP。Nakano等[10]利用丙烯葡聚糖凝膠S-200色譜先后在p H=7.0和p H=3.5條件下純化GMP，提純后的GMP占酪蛋白酸溶液干重的5.6%；Sliva-Hernandez等[11]利用陰離子交換和疏水作用色譜法從山羊甜乳清提取GMP，得率為0.6 g/L；陳緒卓等[12]將乳清粉經TCA沉淀及IRA93離子交換樹脂處理后，GMP得率在74%左右；刁瑞麗等[13]利用優化得到陰離子交換樹脂分離工藝，從100 g乳清粉中得到1.45 g GMP（SA含量為10.4%）。層析法雖然分離效果較好，但高成本使其難以推廣到產業化生產過程中。

2.1.3 超濾法

利用不同pH值下GMP分子量具有差異性這一特性，可選用適當截留分子量的超濾膜分離GMP。將干酪乳清pH值分別調至3.1和6.7，先后過20 kd和5 kd的超濾膜，可獲得純度較高的GMP。馬嵐[15]和趙浩宇等[16]

先利用無水乙醇使大部分雜蛋白沉淀（可降低料液粘度，提高超濾效率），再將上清液進行超濾，得到的CGMP純度分別達到92.45%和92.62%；張秀媛等[17]

采用超濾法得到相對較純的GMP，蛋白質回收率為1.77%；曹榮安等[18]通過單因素和正交試驗確定了GMP的超濾和納濾工藝參數，在最優工藝下GMP純度可達74.50%。膜過濾技術和離子交換色譜均能有效分離純化GMP，因此研究者常結合兩種方法從干酪乳清、酶凝干酪乳清和WPC原料中分離GMP，可以達到較好的純化效果。Kreuβ等[19]利用陰離子交換膜吸附色譜法進行GMP半規模化生產，經超濾后產品純度達91%；胡贊揚[20]和王子波等[21]

利用超濾和離子交換層析制備的GMP純度分別為83.97和96.56%。膜分離法操作簡便，較適用于工業化生產，但膜污染問題制約了該方法的廣泛應用。

2.1.4 雙水相系統法

雙水相系統法是根據生物分子在雙水相體系中選擇性分配來達到分離的目的。Silva等研究證明16%聚乙二醇（PEG）1500+11.43%磷酸鉀（p H=7.0）和15.0%PEG 1500+18.9%檸檬酸鈉（pH=8.0）雙水相系統的GMP回收率分別為93.95%和95%[22-23]；Wu等[24]利用18%PEG 6000+15%硫酸銨雙水相系統的蛋白回收率為69.2%。此方法雖然GMP回收率高，但存在產品純度低、浪費水資源的問題。

2.1.5 殼聚糖法及其他

殼聚糖為弱堿性，表面帶正電荷，將殼聚糖小球加以修飾后可用于分離GMP。Li C等[25]利用β-環糊精修飾殼聚糖，可將GMP的吸附量增至90.23%；閆亞麗等[26]在殼聚糖法分離GMP的最佳工藝條件下可回收83.3%的GMP（SA質量分數為10 mg/g）。王艷萍等[27]在最佳酶解條件下酶解酸凝干酪素，此方法的GMP得率為17.91 mg/g；Tolkach[28]結合酶聯技術和膜分離技術分離CMP及乳清蛋白，且分離效果較好；李博智等[29]利用谷氨酰胺轉氨酶結合微濾技術得到純度為70%的GMP；Kim等[30]利用基因工程法獲得相應的GMP粗品，在超濾和離子交換層析后得到重組人乳GMP純度高達94%以上。

2.2 GMP的分析方法

由于乳源GMP有多種變異體，故迄今為止還沒有非常成熟的直接測定方法，只能進行定性和間接定量分析。

2.2.1 比色法

GMP幾乎不含芳香族氨基酸，因此在普通蛋白檢測波長280 nm處無吸收峰且考馬斯亮藍法無法對其質量分數進行測定。GMP僅在205～217 nm范圍內可檢測到吸收值，因此經常用OD280/OD210的值來間接反映GMP的純度[20]。雖然比色法操作便捷，但準確度不高。

2.2.2 間苯二酚-鹽酸法

GMP中含SA的的結合糖鏈高達90%以上，因此檢測其包含的SA質量分數可間接反映樣品中GMP的質量分數。間苯二酚-鹽酸法是測GMP中SA質量分數的常用檢測方法，其能夠同時測定游離和結合的SA，但特異性和靈敏性都較低[31]。

2.2.3 電泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是測定蛋白分子量的常用方法，但是此方法僅適用于檢測多聚體的GMP且不能檢測到大多數含唾液酸的GMP，因此誤差較大[32]。此外，利用SDS-尿素凝膠電泳和醋酸纖維素（CAS）電泳也可得出GMP的大致分子量和質量分數。

2.2.4 高效液相色譜法

利用反相高效液相色譜法可以進行GMP成分及SA質量分數的分析[33]；閆亞麗等[34]對多種常用的GMP檢測方法進行了比較分析，并認為高效液相色譜法具有純度誤差小等優點；Molle等[35]在檢測GMP時采用色譜—質譜聯用技術，定量地測出GMP的總量。雖然反相高效液相色譜與質譜聯用是檢測GMP較有效的方法，但仍然無法獲得完整的GMP圖譜。

2.2.5 氨基酸組成測定法

蛋白質和多肽均有特定的氨基酸組成，因此通過測定樣品的氨基酸組成，將結果同其理論值對比后即可確定樣品純度。Thoma等[36]利用氨基酸分析儀測定了GMP氨基酸組成，并將氨基酸摩爾質量與理論值進行對比，最終算出產品純度。

3 GMP的生理活性

GMP的生物活性和營養特性均較為豐富，在藥品、保健食品等領域應用前景較為廣闊。

3.1 調節免疫系統應答及抗炎

當機體受到抗原刺激時，免疫系統會通過一系列的生理反應以清除抗原，從而維持內環境的穩定，即為免疫系統調節。GMP抑制結腸組織細胞的凋亡，誘導小鼠腸黏膜產生獲得性免疫應答，緩解潰瘍性結腸炎[37-38]。Mu?oz等[39]發現GMP可通過抑制Th2型免疫應答緩解過敏性皮炎及瘙癢癥狀；Sawin等[40]證明GMP可降低脫硫孤菌屬（與炎癥性腸病的發病機制和生成硫化氫細胞毒性化合物有關）、增加短鏈脂肪酸（可增強腸屏障功能和降低p H值），從而發揮腸道抗炎作用；Cheng X等[41]提出GMP木瓜蛋白酶酶解物可抑制脂多糖與Toll樣受體-4/髓樣分化蛋白2復合體結合，阻斷巨噬細胞中核因子-κB通路，抑制脂多糖刺激性炎癥反應，且效果顯著優于GMP本身。

3.2 抑制細菌和病毒粘附

GMP與受體的高相似性有利于阻止病毒或細菌結合受體，進而抑制病毒或細菌在宿主細胞定植。Kawasaki等[42]發現GMP對流感病毒紅細胞凝集具有抑制作用，而且唾液酸在GMP與流感病毒的反應中起著不可或缺的作用；Dosako等[43]發現GMP可以抑制Epstein-Barr病毒誘導的外周血淋巴細胞的形態改變；Zhang&Shapiro[44]發現木糖醇與GMP具有協同效應，不僅可以防齲齒還能重新礦化牙齒；劉鵬[45]證明其制取的GMP粗提物對變形鏈球菌有較高的抑制率，在質量濃度為12 mg/mL時可達88%。

3.3 結合大腸桿菌毒素及霍亂毒素

霍亂毒素是霍亂弧菌產生的外毒素，其亞單位B一旦與細胞壁上寡糖結合后，A亞單位活化細胞的腺普酸環化酶，會使細胞失水，從而引起腹瀉。Oh等[46]證實糖基化GMP可以通過結合霍亂毒素來抑制毒素與受體結合；Isoda等[47]發現GMP可以抑制大腸桿菌腸毒素（LT-I及LT-II）與中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1）的結合；Rong等[48]通過體外實驗發現GMP可以顯著緩解由大腸桿菌感染引起的生長性能下降和腹瀉，抑制仔豬腸道炎癥。

3.4 促進腸道益生菌的增殖

N-乙酰葡糖胺或寡糖末端有N-乙酰葡糖胺的結構可促進雙歧桿菌生長。Gyorgy等[49]發現GMP經唾液酸酶水解后會暴露出次末端的N-乙酰葡糖胺，從而能促進雙歧桿菌生長。任效東等[50-52]研究了GMP對小鼠腸道菌落環境的影響，實驗證明GMP具有調控和促進腸道雙歧桿菌等有益菌，同時抑制腸桿菌、腸球菌等致病菌的作用，乳源GMP可通過調節失衡的腸道菌群來改善結腸炎；李楠等[53]提出GMP酶解物對歧桿菌的促生長效果優于GMP本身，且有效成分可能是水解產生的多肽類物質。

3.5 抑制胃腸道分泌物

GMP會刺激小腸黏膜分泌縮膽囊素（可抑制胃酸等的分泌）[54]，胃液分泌量的減少可使活性分子（溶菌酶、免疫球蛋白和乳鐵蛋白等）不被胃過多消化，完整地進入小腸并被高效吸收，從而達到有效保護胃腸道的效果。通過動物實驗發現飼喂或灌胃GMP可以在1～2 h內明顯抑制胃液分泌，但靜脈注射GMP無抑制胃分泌或改變胃腸激素血漿水平的作用[55]。

3.6 調節脂肪代謝

科學家們運用基因工程技術從釀酒酵母菌上得到了重組人GMP，實驗表明此GMP是通過增加脂肪排出量的方式調節脂質代謝、預防脂質堆積和肥胖[30]。劉雪姬等[56]經實驗證明調控腸道菌落微環境可以降低高脂飲食所引發的代謝性疾病發病率；成雪等[57]通過脂肪細胞與巨噬細胞共培養體系發現GMP酶解物對脂肪組織炎癥的抑制作用顯著；Xu等[58]提出GMP對小鼠由高脂肪飲食引起的肥胖有改善作用，可促進脂肪分解代謝，減少脂肪堆積。上述研究為GMP可調節脂肪代謝及肥胖相關炎癥提供了理論基礎。

3.7 抑制糖尿病、抗氧化等活性

Song等[59-60]發現GMP酶解物可以對二肽基肽酶-4產生抑制作用，且IPPKKNQDKTE肽段可通過AMP依賴的蛋白激酶活化作用調控胰島素受體底物-1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路，改善Hep G2細胞由高糖引起的抗胰島素性，對抑制糖尿病方面有潛在作用；Li等[61]發現GMP酶解物可通過上調HepG2細胞內的HO-1的表達來緩解細胞氧化應激損傷；在含β-乳球蛋白食物的體外消化過程中若存在GMP，可顯著減少β-乳球蛋白與免疫球蛋白結合，降低β-乳球蛋白潛在過敏性[62]；GMP還具有促進礦物質吸收、促進智力、抗血栓等作用。

4 結語

相比國外，國內關于GMP的分離純化及生物活性研究較落后，國外已經將GMP應用于牙膏、餅干、餅干、嬰幼兒食品及醫藥制品中。近些年，我國對GMP的生物功能研究正逐步全面化，至今已已對其免疫調節、抑菌、抗血凝、調節胃腸道、抗氧化等活性進行相關研究。由于GMP在乳清粉中的含量較低，提取率不高，結構復雜，目前并沒有經濟有效的適合規模化生產GMP的分離純化方法，因此在國內并沒有實現市場化。GMP的獨特結構和生物功能具有極高的研究價值，隨著科技技術的發展，GMP將會在國內逐步實現工業化，并應用于食品、藥品及化妝品領域。