含乳食品中動物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測

郭有輝，楊艷秋，胡露，唐懋，王麗娜，葉梅

（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610100）

0 引 言

隨著國民生活質量的提高，食品安全問題日益受到全社會廣泛關注。動物水解蛋白是以動物皮革中的膠原蛋白為原料，水解精制而成的產物，此類物質加入到食品中會帶來潛在的危害。在乳及乳制品中添加動物水解蛋白的主要目的是為了降低成本，以提高產品含氮量，追求利潤而添加。因此，區分乳蛋白和動物水解蛋白顯得尤為重要。

目前用于測定動物水解蛋白L-羥脯氨酸的方法主要有分光光度法和高效液相色譜法，但這兩種方法操作繁雜，水解時間過長，不適合大批量樣品的分析。

本實驗參考了相關文獻[4-8]。對試樣中羥脯氨酸的水解方法進行了改進和優化，通過改進的硫酸溶液烘箱恒溫水解法縮短了分析時間，操作安全簡單，并且適用于大批量實驗操作。

1 實 驗

1.1 材料

乳粉、乳飲料、滅菌乳、豬皮膠原蛋白粉（市售）。

1.2 試劑

硫酸，氫氧化鈉，檸檬酸，結晶乙酸鈉，正丙醇，氯胺T，對二甲氨基苯甲醛，高氯酸，L(-)-羥脯氨酸（Aifa Aesar)。本研究所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計，酸度計，電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.4 方法

1.4.1 實驗原理

試樣經硫酸于120℃水解釋放出L(-)-羥脯氨酸，經氯胺T氧化、生成含有吡咯環的氧化物，用高氯酸破壞過量的氯胺T，L(-)-羥氨酸氧化物與對二氨基苯甲醛反應生成紅色化合物，在558 nm波長處測定吸光度，并與標準曲線系列比較定量。

1.4.2 試劑配制

硫酸溶液（6 mol/L）：量取約500 mL于1 L容量瓶中,在攪拌下緩慢加入320 mL濃硫酸(ρ=1.84 g/mL),冷卻后用水定容；

緩沖溶液(pH值為6.8)：分別準確稱取26.0 g一水檸檬酸，14.0 g氫氧化鈉，78.0 g三水乙酸鈉，用500 mL水溶解上述試劑并轉入1 L的容量瓶中，加入250 mL的正丙醇，用水定容；

氯胺T：準確稱取1.41 g三水·N－氯－對甲苯磺酰胺鈉鹽(氯胺T)，加入100 mL緩沖溶液溶解，臨用前配置；

顯色劑：稱取10.0 g對二甲基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶液（60%）溶解，緩慢加入65 mL異丙醇，臨用前配置；

羥脯氨酸標準儲備液：稱取50 mg 4－羥基－α－吡咯甲酸(羥脯氨酸)于100 mL容量瓶，用水溶解加入一滴硫酸溶液，用水定容，此標準儲備液質量濃度為500μg/mL；

氫氧化鈉溶液（濃度10 mol/L，1 mol/L）；

羥脯氨酸標準工作液5.0μg/mL：吸取標準儲備液5.00 mL于500 mL容量瓶中定容。

1.4.3 樣品前處理

稱取液體樣品5.0 g（固體樣品1.0 g加水至5.0 g左右)至100 mL具塞比色管或具塞三角瓶中，加入25 mL濃度為6 mol/L的硫酸溶液，蓋上塞子，放入恒溫干燥箱中，120℃恒溫水解4 h。趁熱將水解產物轉移至200 mL容量瓶中，用10 mL硫酸容液分三次洗滌具塞比色管或具塞三角瓶，合并洗液至上述容量瓶中。用水定容，搖勻，所得濾液為樣品水解液。

吸取25.0 mL水解液于100 mL燒杯中,用濃度為10 mol/L和1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值為8±0.2，過濾于100 mL容量瓶中，用水沖洗燒杯和濾紙上的氫氧化亞錫沉淀，反復3次，把洗液并入濾液中，以水洗到刻度，搖勻備用。同時做空白試驗。

1.4.4 試樣測定

吸取 L(-)-羥脯氨酸標準工作液 0.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50.00 mL；分別置于100 mL容量瓶中，搖勻定容。標液質量濃度分別為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL。分別準確吸取4.0 mL制備好的濾液和不同質量濃度的L(-)-羥脯氨酸標準工作液于25 mL具塞比色管中，加氯胺T溶液2.0 mL，搖勻后于室溫放置20 min。加入顯色劑2.0 mL，充分混勻后，迅速將比色管放于入60℃恒溫水浴中保溫20 min后取出，流水浴迅速冷卻比色管，在波長558 nm處測定吸光值,繪制標準曲線，樣品以扣除了空白溶液的吸光值，從所得的標準曲線查找對應的濃度，然后計算出樣品中羥脯氨酸的含量。

2 結果與討論

2.1 標準工作曲線繪制

本方法的標準曲線以扣除試劑空白的標準溶液的吸光度為縱坐標，以相應的標液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為Y=0.208X+0.000，R2=0.999。由圖1可以看出，表明標準樣品溶液的吸光度Abs和羥脯氨酸的濃度之間存在很好的相關性。

2.2 實驗水解條件選擇

3個摻加3%，5%，10%豬皮膠原蛋白粉的乳粉樣品各26組分別采用濃度為3 mol/L和6 mol/L的硫酸溶液在120℃恒溫烘箱中水解樣品，水解不同時間測得的羥脯氨酸質量濃度檢測結果如表1所示；采用濃度為6 mol/L的硫酸溶液在不同溫度的恒溫烘箱中水解樣品4 h測得羥脯氨酸的質量濃度檢測結果如表2所示。

圖1 L-羥脯氨酸標準工作曲線

表1 不同水解時間測得羥脯氨酸質量分數結果 mg/g

表2 不同溫度下水解樣品測得羥脯氨酸質量分數結果 mg/g

結果表明，使用3 mol/L硫酸溶液水解樣品，樣品A使用3 mol/L硫酸溶液水解在6 h后測得的羥脯氨酸質量濃度變化不大，樣品B、C使用3 mol/L硫酸溶液水解在8 h也不能判定是否水解完全，而使用6 mol/L硫酸溶液水解時間超過4h三個樣品測得的羥脯氨酸質量濃度變化不大，水解反應完全 。使用6 mol/L硫酸溶液在不同溫度下水解樣品4 h測定結果表明，樣品在120℃水解后測定結果基本趨于穩定，水解反應完全。依據表1、表2的試驗數據，及考慮方法適用的寬泛性（滿足不同羥脯氨酸含量的樣品），樣品水解的硫酸溶液濃度選用6 mol/L，而水解時間選為4 h，水解溫度選為120℃。

2.3 試樣水解方法的改進優化

目前國內實驗室通常采用的由中國檢驗檢疫科學院提供的“乳與乳制品中動物水解蛋白鑒定—L（-）-羥脯氨酸含量的測定”文獻方法。但是該方法中提供的兩種試樣處理方法均有不盡人意的地方，方法分析時間長、操作繁瑣、不適合批量操作。本方法對試樣的水解方法進行了改進優化，實驗采用硫酸溶液代替鹽酸溶液水解。因為鹽酸易揮發，所以其水解的時候必須用水浴加熱冷凝回流裝置，而水浴加熱不適用于大批量操作，而硫酸溶液不易揮發所以采用烘箱恒溫替代水浴加熱回流，同時將烘箱的溫度提升到120℃，恒溫水解時間縮短到4 h。

2.4 檢測方法比較

取乳粉、乳飲料、滅菌乳及摻加3%，5%，10%豬皮膠原蛋白粉的乳粉樣品。分別采用本方法與中國檢驗檢疫科學院提供的文獻方法[2]及肉制品國標法[1]三種檢測方法同時進行L-羥脯氨酸測定，測定結果見表3。

表3 3種檢測方法測定結果比較 mg/g

由表3可以看出，未摻加豬皮膠原蛋白粉的乳粉，乳飲料，滅菌乳樣品三種檢測方法均未檢出，結果一致。摻加豬皮膠原蛋白粉的樣品三種檢測方法測定結果基本一致，相對偏差都小于10%。乳粉中羥脯氨酸質量濃度與膠原水解蛋白的質量濃度呈正相關，羥脯氨酸質量濃度變化可以反映乳粉中摻加的豬皮膠原水解蛋白粉的情況。文獻[2]中報道羥脯氨酸約占膠原蛋白氨基酸總量的10%左右，本實驗中實際摻加的豬皮膠原水解蛋白粉的質量分數分別為3%，5%，10%；經本實驗測得羥脯氨酸的質量濃度換算，得到該豬皮膠原蛋白粉的羥脯氨酸質量分數分別為10.2%，11.0%，10.5%；與文獻[2]中報道吻合。實驗表明本方法適用于含乳食品中L(-)-羥脯氨酸質量分數的測定。

2.5 方法測定低限

控制相同的實驗條件，以消除系統誤差的空白樣品作為測定對象，進行重復測定20次，得到空白的吸光度。同樣的實驗條件下以5μg/g標準樣品作為測定對象，重復測定得到標準樣品的吸光度。通過計算得到方法的測定低限為50μg/g。

2.6 方法準確度的實驗

本實驗準確度采用加標回收實驗，稱取1.0 g混合均勻后的乳粉樣品，加入方法測定低限(50μg)、兩倍方法測定低限(100μg)、十倍方法測定低限(500μg)的L-羥脯氨酸標準物質，然后按本方法1.4進行處理后測定，其樣品加標回收實驗結果如表4所示。

表4 加標回收實驗結果 μg

實驗表明樣品加標回收率為92.4%～96.2%，滿足GB/T 27404-2008實驗室質量控制規范食品理化檢測附錄F檢測方法確認的技術要求[3]，表明本實驗完全滿足檢測方法確認的準確度要求。

2.7 方法精密度實驗

按試驗方法，平行測定3個加入羥脯氨酸標準物質的乳粉樣品重復測定10次。對測定結果進行數據處理，計算出標準偏差S和變異系數CV%，考察該方法的精密度，結果如表5所示。

表5 精密度實驗測定結果 μg

由表5可以看出，本方法測定羥脯氨酸的標準偏差S為0.75～4.03，變異系數CV為1.6%～2.5%，方法精密度較高。滿足GB/T 27404-2008實驗室質量控制規范食品理化檢測附錄F檢測方法確認的技術要求[3]，表明本研究完全滿足檢測方法確認的精密度要求。

3 結論

本實驗建立了快速、準確測定含乳食品中動物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測方法。方法測得的回收率在92.4%～98.2%之間，相對標準偏差RSD為3.95%。本研究方法準確度，精密度均滿足GB/T 27404-2008實驗室質量控制規范食品理化檢測附錄F檢測方法確認的技術要求。結果表明，方法操作簡單安全、準確度高、精密度好、縮短了檢測周期，可大批量操作。解決了通常實驗室采用方法中的批量操作不適用以及分析時間過長的問題。方法能夠滿足含乳食品中的動物水解蛋白L（-）-羥脯氨酸含量的測定，以判定食品中是否添加了動物水解蛋白，為食品安全提供保證。