HPLC法測定特殊醫學用途嬰配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的研究

李濤，周艷華，孫桂芳，楊滔，楊慶懿

(1.湖南省食品質量監督檢驗研究院長沙 410111；2.長沙環境保護職業技術學院長沙 410004）

0 引 言

特殊醫學用途嬰兒配方食品（以下簡稱特醫嬰配食品）是部分患病嬰兒生命早期或出生后相當長時間內賴以生存的唯一或主要食物來源，《食品安全國家標準特殊醫學用途嬰兒配方食品通則》對各項營養指標進行規定[1-2]。維生素E又名生育酚，具有多種異構體，具有消除體內自由基、促進血液循環等多種生理功能，自然界分布最廣泛和含量最高的是α-生育酚[3]。α-生育酚醋酸酯是由α-生育酚的酚羥基乙酰化得到，不易受空氣、光、紫外線的作用氧化，具有更好的穩定性和藥理功效[4]。維生素E是特醫嬰配食品中一項重要的營養指標，對于嬰兒尤其是新生兒、早產兒的生長發育過程有著重要的影響，添加形式為α-生育酚及α-生育酚醋酸酯[5-7]。目前，現有維生素E測定主要有液相法和液相色譜串聯質譜法，現有食品安全國家標準中維生素E測定是一般需對樣品進行酶解、皂化、提取、分離、濃縮等步驟，操作極其繁瑣耗時[8-10]。特醫嬰配食品中維生素E的檢測未見報道，特醫嬰配食品有6種配方，經研究發現依照現有標準中皂化條件進行皂化，會出現皂化不完全、嚴重乳化、維生素E結果偏低等現象，且α-生育酚不穩定，在此分析過程中易損耗，回收率不高，不能進行批量操作。此試驗采用正向高效液相色譜直接測定特殊醫學用途配方食品中的α-生育酚和α-生育酚醋酸酯[11]。此檢驗方法能準確測定產品中α-生育酚營養強化類別及含量，指導特醫生產企業對產品的質量控制，也為特醫嬰配食品中維生素E檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

特醫無乳糖配方奶粉（A）、特醫乳蛋白部分水解配方奶粉（B）、特醫乳蛋白深度水解配方奶粉（C1）/氨基酸配方奶粉（C2）、特醫早產/低出生體重嬰兒配方乳(D)、特醫母乳營養補充劑（E）、特醫氨基酸代謝障礙配方乳（F）來源于雅培等企業。

標準品：純度96.0%DL-α-生育酚（上海安譜）；純度98.4%DL-α-生育酚醋酸酯，（Dr.E）；異丙醇、叔丁基甲醚、正己烷、甲醇、無水乙醇、異辛烷、均為色譜純（上海安譜）；對苯二酚、冰醋酸、無水乙酸鈉、鹽酸，均為分析純（上海安譜）；木瓜蛋白酶＞400 U/mg，（BoMei0696）。

1.1.2 主要儀器設備

LC-20A高效液相色譜儀(帶DAD檢測器，日本島津公司)，HMS-350漩渦振蕩器（上海珂淮儀器有限公司），BS224S電子分析天平（德國賽多利斯公司），X 1R臺式冷凍離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），PB-10 pH酸度計（德國賽多利斯公司），HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備

分別稱取α-生育酚醋酸酯和α-生育酚約25 mg（準確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，異辛烷溶解并定容至刻度。分別精取1.0 mL標準溶液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得100.0μg/mL混標儲備液，分別精取0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、4.0 mL混標儲備液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得濃度為0.5～40.0μg/mL的標準使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

（1）樣品稱量固體樣品混勻后精確稱重0.5 g至50 mL離心管；液態樣品精確稱取5.0 g至50 mL離心管中。

（2）酶解800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取250 mg對苯二酚和10.0 g無水醋酸鈉于250 mL容量瓶中，加水200 mL溶解，用鹽酸溶液調節pH至5.0，加入0.5 g木瓜蛋白酶超聲5 min，冷卻后定容至刻度。向樣品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混勻后置于37±2℃水浴30 min后冷卻。

（3）提取向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振蕩15 min，精密加入10.0 mL異辛烷振蕩提取15 min，5 000 r/min離心機中離心10 min，取異辛烷層用于高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax NH2（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流動相A為正己烷，流動相B為25%叔丁基甲醚正己烷，流動相梯度洗脫程序詳見表1；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：50μL；熒光檢測器的激發波長為280 nm，發射波長為310 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

取標準使用液注入液相色譜儀測定，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1和圖2。α-生育酚醋酸酯線性方程為：Y=266 153.35X+2 760.08(R2=0.999 9)，α-生育酚線性方程為 Y=1 552 209.8X-89 555.89(R2=0.999 5)，標準工作液濃度在0.5～40.0μg/mL范圍內，校準曲線線性良好。

圖1 α-生育酚醋酸酯標準曲線圖

圖2 α-生育酚標準曲線圖

2.2 檢出限和定量限

取空白響應值的2～3倍對應濃度的混合標準溶液0.5μg/mL，平行測定11次，根據檢出限的計算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd為標準偏差，b為工作曲線斜率)，當取樣量為0.5 g，異辛烷提取體積為10.0 mL時，方法檢出限和定量限見表2。此方法的檢出限與定量限低于GB 5009.82-2016，說明此檢驗方法具有更高的靈敏度。

2.3 樣品含量測定和精密度試驗

特醫嬰配食品A-F分別平行取樣6組，按供試品溶液制備方法制備，進液相色譜測定，特醫嬰配食品A-F號中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚含量及精密度結果見表3和表4。結果顯示6種特醫嬰配食品配方中均添加α生育酚醋酸酯和α-生育酚，且添加量依據適用對象的差異而不同，母乳營養補充劑中α-生育酚醋酸酯含量最高，氨基酸配方中α-生育酚含量最高；各配方中α-生育酚醋酸酯含量為0.37～69.0 mg/100g，精密度為0.6%～9.9%，α-生育酚含量為0.16～8.4 mg/100g，精密度在1.3%～7.2%之間，精密度均滿足測定要求。

表2 檢出限和定量限

表3 特醫嬰配食品中α-生育酚醋酸酯含量及精密度

表4 特醫嬰配食品中α生育酚含量及精密度

2.4 加標回收率試驗

選取深度水解配方奶粉（C1）為代表進行特醫嬰配食品回收率試驗，共9份，每個濃度3份，分別添加12.0μg、24.0μg、40.0μg的混合標準溶液，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進液相色譜測定。α-生育酚醋酸酯和α-生育酚加標回收率見表5。由表5可知，α-生育酚醋酸酯在不同添加濃度下回收率在80.2%～91.1%之間，RSD值為0.7%～5.4%，α-生育酚在不同添加濃度下回收率在80.4%～94.8%之間，RSD值為1.8%～5.8%之間，深度水解配方奶粉為特醫嬰配奶粉中最復雜基質之一，說明該方法對特醫嬰配食品中不同濃度α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測定具有較高的準確度。

表5 樣品加標回收率

2.5 檢驗方法的選擇性

圖3和圖4分別為混合標準溶液和7種特醫嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的圖譜，α-生育酚醋酸酯保留時間為4.7 min，α-生育酚保留時間為12.1 min，樣品長時間測定過程中α-生育酚醋酸酯保留時間會發生一定變化，因此測定過程中需添加標準溶液進行定性。特醫嬰配食品成分及其復雜，但應用熒光檢測器進行檢測，由圖4可知，未發現基質干擾，表明該檢驗方法對特醫嬰配食品中中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚具有良好選擇性，分離度高。

圖3 標準溶液中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

3 結論

試驗建立正相液相色譜測定特醫嬰配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測定方法。采用木瓜蛋白酶酶解蛋白質，游離包裹的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，酸化甲醇沉淀蛋白質類物質，異辛烷提取，氨基柱正相分離，熒光檢測。在0.5～40.0μg/mL范圍內呈線性相關，α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢出限分別為5.6μg/100g和6.9μg/100g，不同添加濃度回收率為80.2%～94.8%。

圖4 特醫嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

維生素E活性用α-生育酚當量（α-TE）表示，1 mgα-TE=1 mg d-α-生育酚，用此檢驗方法檢驗特醫嬰配食品中維生素E（α-TE）含量時需折算，1 mg dl-α-生育酚=0.74 mg d-α-生育酚，1 mg dl-α-生育酚醋酸酯=0.67 mg d-α-生育酚，此檢驗方法的線性范圍和檢出限均優于現有食品安全國家標準GB 5009.82-2016。前期試驗研究表明現有國標測定特醫嬰配食品中α-生育酚時，多種配方產品皂化時會出現乳化現象嚴重、皂化不完全和精密差等問題。本試驗方法采用直接測定樣品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，避開操作繁雜的皂化過程，操作簡單，精密度和準確度高，可實現批量檢測。此試驗建立的檢測方法簡單、快速、準確，針對特醫嬰配產品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢測重復性好，為特殊醫學用途食品生產廠家進行質量控制提供指導，也為檢測特醫嬰配食品中維生素E提供技術參考。