乳中耐冷菌脂肪酶活性測定方法進展

徐明亮，游春蘋，高海燕，劉振民

(1.乳業生物技術國家重點實驗室上海乳業生物工程技術研究中心光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436;2.上海大學生命科學學院，上海 200444）

0 引 言

市場上銷售的液態奶主要包括巴氏殺菌奶和超高溫瞬時滅菌(ultra-high temperature，UHT)奶。與巴氏殺菌奶相比，UHT奶解決了液態乳運輸、貯存、保鮮難的問題，降低了牛乳顏色、風味和營養價值的損失。但UHT奶在長期存放過程中仍可能發生劣變，主要原因之一是原料奶可能污染了一些耐冷菌，這些耐冷菌產生耐熱蛋白酶和脂肪酶[1-3]。這些耐熱酶在經過熱處理后如巴氏殺菌甚至UHT后仍會有酶活性殘留。Choi等[4]研究表明，在UHT奶儲存期間仍殘留活性的脂肪酶水解脂肪生成的游離脂肪酸含量明顯增加，造成UHT奶酸度的增加，引發酸敗，對UHT奶質量及儲存期間的質構和風味穩定性造成不良影響[5]。而蛋白酶降解乳中的酪蛋白，產生疏水性多肽，會導致乳品發苦。為了保證乳品質量安全及貨架期內穩定性，奶中耐熱脂肪酶的研究具有非常重要的意義。

1 耐冷菌的概念及特性

乳品生產加工過程中，微生物污染是引起乳品質下降的主要因素之一。而耐冷菌是影響乳及乳制品質量安全的關鍵微生物。耐冷菌[6]分為兩類：一類為專性嗜冷菌（Psychtrophiles），最高生長溫度不高于20℃，最適生長溫度為15℃或更低溫度，在0℃仍可以生長繁殖，如耶氏菌、李斯特菌；另一類為兼性嗜冷菌（Psychrotrophs通常也被稱為耐冷菌，本文所述耐冷菌皆為此類），最高生長溫度高于20℃，最適生長溫度高于15℃，在0～5℃仍可以生長繁殖，如假單胞菌。

專性嗜冷菌對溫度變化比較敏感，對原料乳及乳制品的影響較小。而耐冷菌廣泛存在于原料乳的外部環境中，在原料乳的低溫儲藏、運輸加工過程中，耐冷菌選擇性生長，成為原料乳中的優勢菌群[7]。因此耐冷菌極易對原料乳造成污染。

原料乳中耐冷菌數量過多及其產生的耐熱性脂肪酶會影響UHT奶的風味和品質[8]。耐冷菌的本身繁殖生長在生產過程中一般不會引起乳品的嚴重腐敗變質，巴氏殺菌很容易殺死這些細菌[9]，但是一些耐冷菌如耐冷假單胞菌分泌的耐熱性脂肪酶在巴氏殺菌后依然存在，會導致乳品變質。甚至在UHT處理后仍有部分殘留活性，它們能繼續分解乳中脂肪產生游離的脂肪酸，導致乳及乳制品的風味劣化[10]、質構破壞，從而降低乳品質量，縮短乳品的保質期[1-3]。

2 牛乳中脂肪酶分類及特性

脂肪酶是一種水溶性的胞外酶，可以催化三酰基甘油的水解，促進其釋放游離脂肪酸和甘油[11]。乳中脂肪酶主要有天然脂肪酶和微生物脂肪酶兩部分組成。原料乳中的天然脂肪酶有兩種：一種吸附于脂肪球膜界面間，稱為膜脂酶，在末乳和乳房炎乳中含量很高；另一種以酪蛋白結合狀態存在，稱為乳漿脂酶，它會由于牛乳的均質而吸附于脂肪球上。牛乳中的微生物脂肪酶主要來源于耐冷菌（尤其是假單胞菌），大部分耐冷菌產生的脂肪酶都具有較強耐熱性，甚至是在高溫殺菌后仍有不同程度的酶活性存在。

微生物脂肪酶的最適反應溫度一般在30～50℃之間，但有些脂肪酶在1～8℃甚至是更低的溫度-10～-30℃也能引起食品的腐敗變質。耐冷菌中的假單胞菌產生的脂肪酶的最適pH值在8～9之間。其在乳中有相當大的活性[12]。研究發現每毫升原料乳中含有0.0012 U的耐熱脂酶時，在室溫下貯存四周就會出現腐敗。脂肪酶分解乳脂肪產生的游離脂肪酸含量超過65μg/mL時，乳品就會出現風味缺陷[13]。

3 乳中耐冷菌脂肪酶酶活力檢測前處理

酶活力檢測時，酶前處理及底物的制備是非常重要的。細菌脂肪酶的處理通常是先通過菌體的活化復壯，然后用產酶培養基對菌體恒溫培養，再將培養液離心處理取上清得到粗酶液。在菌體培養時不同耐冷菌有不同的最佳產酶條件，可根據其最佳產酶條件進行培養。如果酶活力過低可對粗酶液純化使酶活性達到最高。脂質底物通常加入表面活性劑（膽酸鹽、膠等）而形成穩定乳液后再加入反應體系。酶反應結束后如果反應體系渾濁，可加入澄清劑。

4 乳中耐冷菌脂肪酶活力的檢測方法

乳中耐冷菌脂肪酶活力測定方法根據檢測指標不同可分為兩類：一類是通過測定底物的減少量；一類是通過測定產物的增加量。另外根據檢測手段的不同有平板法、濁度分析法、滴定法、比色法、熒光法、色譜法等。

4.1 平板法

原理：平板法測定脂肪酶的活性主要是依據脂肪酶將瓊脂平板中的底物（如三丁酸甘油脂）催化生成的游離脂肪酸與瓊脂中的指示劑（羅丹明B或維多利亞藍）反應，在瓊脂平板上形成比較清晰的水解圈。由于水解圈有效直徑的大小與酶活力對數呈線性關系，因此可根據水解圈直徑對酶活力進行定性和定量分析[14-15]。

此法多適用于細菌堿性脂肪酶活性的快速粗略測定。通過改變瓊脂平板中的底物以及pH等條件，可以很方便地用于其它酶活性的測定。

4.2 濁度分析法[16]

原理：脂肪酶對三酰基甘油如三丁酸甘油酯乳液的反應導致濁度的降低。該降低的速率與脂肪酶的活性直接相關。渾濁度的減少可以通過凝膠狀乳劑中的澄清區域的大小來測量。

Smeltzer等[17]研究表明此法可以檢測1μg/mL假單胞菌脂肪酶的活性，Lawrence等[18]研究表明濁度分析法可以檢測0.06μg/mL微球菌脂肪酶的活性。Choi等[4]已經用三丁酸甘油酯擴散方法成功的檢測了UHT乳中低含量脂肪酶的活性。

4.3 滴定法[19]

原理：利用脂肪酶將乳化的橄欖油水解成脂肪酸和甘油，再使用標準堿溶液結合指示劑對產物脂肪酸進行酸堿滴定（或直接用p H酸度計代替指示劑），由耗堿量求出脂肪酶的活性。包括p H-stat法[20]、溶劑萃取滴定法。

此法設備便宜、操作簡單，可廣泛應用于奶及奶制品中的脂肪酶活性測定，但不適用于低含量脂肪酶活性測定。橄欖油的乳化程度是影響測定結果的一個重要因素。

4.4 比色法

4.4.1 β-萘酚法[21-22]

原理：無色疏水性β-萘酯與脂肪酶反應釋放β-萘酚，β-萘酚的重氮鹽反應會導致形成彩色的偶氮染料，由此可通過分光光度法對脂肪酶活性的定量測定。Christen等[13]用此方法與瓊脂擴散法比較了10株熒光假單胞菌的酶活性測定，但當乳脂肪或渾濁存在時會影響測定的靈敏度。

4.4.2 對硝基酚法[23-24]

原理：對硝基酚法是以對硝基苯酚酯作為底物，脂肪酶水解底物產生具有顏色的對硝基苯酚，在相應波長下測出其吸光光度值，再對照對硝基苯酚吸光度工作曲線得出脂肪酶活力。

Humbert等[25]已經證明對硝基苯酚法與萃取滴定法有很好的相關性（r=0.89），但是奶中游離脂肪酸和脂肪的存在會影響對硝基苯酯的水解。

4.4.3 銅皂法[26]

原理：銅皂法是利用脂肪酶將橄欖油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和顯色劑（5%的醋酸酮溶液用吡啶調至p H＝6.1）中的銅離子反應生成銅皂藍色絡合物在710 nm波長下有最大吸收值，再對照脂肪酸吸光度工作曲線得出脂肪酸的濃度，計算酶的活性。

表1 不同脂肪酶活力測定方法歸納比較

Lowry等[27]描述了允許在2.0-14.0μmo（l 0.5～4.0 mg油酸）水平下非常快速測定游離脂肪酸。但操作相對復雜，易受金屬離子的干擾。

4.5 熒光分析法

4.5.1 4-甲基傘形酮[20,28]

原理：熒光化合物4-甲基傘形酮的酰基酯用作脂肪酶活性測定的底物，通過水解釋放的4-甲基傘形酮的熒光是脂肪酶活性的量度。

Vercet等[28]研究表明加入2～50μL脂肪酶溶液即可定時檢測熒光強度，此法相對靈敏快速，但容易受到溫度、pH等的影響。

4.5.2 傘形酮方法[29]

原理：當非熒光傘形酯被脂肪酶水解時，傘形酮的熒光強度直接指示脂肪酶活性。

此法已被報道比4-甲基傘形酮酰基酯更適合進行脂肪酶活檢測。

4.5.3 三酰基甘油取代法

原理：三酰基甘油的一個烷基熒光基團被取代，取代后的三酰基甘油可用作底物來檢測脂肪酶活性。

Celestino等[30-32]已經將1(3)-pyrenylbutanoyl-2,3(1,2)-dipalmitoyl-sn-glycerol（1,2-DPPBA）作為底物的方法應用于奶中脂肪酶活性的檢測。

4.6 色譜法[33-35]

原理：在脂肪酶與酯底物（通常為三酰基甘油）孵育期間形成的游離脂肪酸用溶劑萃取并通過GC或HPLC進行定量。脂肪酸可以從殘留的底物分離，并可以進行色譜分離。

這是實驗室常用的方法，可以用于痕量分析，但是設備昂貴。

4.7 其他

對于脂肪酶活性檢測還有其他方法，如放射性測量法、酶法、物理方法等，可根據脂肪酶特性選擇合適的方法進行酶活力測定。

5 脂肪酶活力檢測方法比較

對于乳品質量安全風險分析及管控來說，微生物產酶篩查及確證工作是非常有意義的。在脂肪酶活力測定時，可以根據脂肪酶的特點選擇相應的方法。表1列舉了幾種脂肪酶活力檢測方法，總結了不同檢測方法的優缺點及應用[36]。

6 結論及展望

通過比較幾種脂肪酶活力檢測方法得知：濁度分析法、酶法及放射性測量法適用于所有脂肪酶活力的測定[16]；滴定法常用于乳脂肪酶及細菌脂肪酶的定性測定；比色法多用于細菌脂肪酶活力定量測定；熒光法及色譜法一般只用于細菌脂肪酶的定性及定量測定。可根據實驗目的、實驗設施及節約成本的原則選擇適宜的方法和底物來檢測脂肪酶活性。

針對酶的不穩定特性，可通過酶的固定化等方式使酶趨于穩定，亦可結合電化學等方法間接檢測酶活性。