植物乳桿菌S72對高達干酪品質的影響

段翠翠，趙子健，趙玉娟，王超，高磊，牛春華，李盛鈺

（吉林省農業科學院農產品加工研究所，長春 130033）

0 引 言

益生菌作為輔助發酵劑添加到干酪加工過程中，對于干酪的成熟具有積極的作用[1]。益生菌在發酵過程中會產生多種抑菌物質，可以抑制有害微生物的生長和致病菌的存活，益生菌還可分解某些有害物質和毒素，有利于提高發酵食品的食用安全性[2]。益生菌可以改善干酪的風味，通過乳糖代謝等作用產生風味物質形成獨特的感官特性；益生菌在發酵過程中產生有益物質如氨基酸、多肽、脂肪酸、礦物質等，豐富了干酪的營養物質[3]。益生菌干酪有益于人體健康，可調節宿主腸道菌群平衡、改善腸道感染、控制膽固醇含量、提高機體免疫力及抑制有害物質積累，因此具有潛在的藥用價值[4]。

本研究利用實驗室前期篩選出的一株具有潛在益生特性和優良發酵功能特性的菌株作為益生菌輔助發酵劑應用于高達干酪的加工中，并研究益生菌對高達干酪品質的影響。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株及發酵劑制備

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）S72來源于長白山地區傳統發酵食品酸菜，體外實驗證實其具有膽固醇清除能力、抗氧化特性及蛋白水解活性，保存于吉林省農業科學院農產品加工研究所菌種庫中。商品發酵劑為R 707干酪專用發酵劑（丹麥CHR HAN-SEN公司）。

L.plantarumS72在12%（V/V）脫脂乳培養基中連續傳代活化后，按3%（V/V）接種于12%（V/V）脫脂乳中，37℃靜置培養16 h，離心（5 000 rpm，4℃，10 min），菌泥用滅菌生理鹽水洗滌兩次，離心（5 000 rpm，4℃，10 min），滅菌生理鹽水調整菌液濃度為1.0×107cfu/mL，4℃冰箱保藏備用。作為干酪加工的輔助發酵劑，添加量為8.0×106cfu/mL。商品發酵劑的添加量按照說明書確定。

1.1.2 主要儀器設備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋（日本Sanyo公司），CK2TRC-3顯微鏡（日本Olympus公司），BCN-1360B無菌超凈工作臺（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司），HZQ-Q電熱恒溫培養箱（上海一恒實驗設備有限公司），梅特勒-托利多Delta320 p H計（瑞士梅特勒-托利多有限公司），TAXT plus型質構儀（英國Stable Micro System公司），HP1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），6890N-5973N氣-質聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 益生菌高達干酪的制作工藝流程

原料乳→過濾→65℃加熱30 min（巴氏殺菌）→冷卻至30℃→加入商品發酵劑（0.03 g/L）和L.plantarumS72輔助發酵劑（8.0×106cfu/mL）→30℃，發酵 30-45 min→加凝乳酶（0.033 g/L）和氯化鈣溶液（0.2 g/L）→30℃，凝乳30～45 min→切割→攪拌15～25 min→熱燙→排乳清→預壓榨2～4 kg/cm2，15～20 min→成型→壓榨4～6 kg/cm2，1～2 h→加鹽（2%，W/W）→貯存→包裝→4℃成熟

1.2.2 干酪理化指標的測定

水分含量測定：參照GB5009.003-2010《食品中水分的測定》；脂肪的測定：參照AOAC905.02（1990）羅紫-哥特里（Rse-Gottlieb）法；蛋白含量測定：參照AOAC920.123（1990）凱氏定氮（Kjeldahl）法。

1.2.3 干酪pH值的測定

稱取10 g Gouda干酪碎塊，加入12 mL溫度為50℃的蒸餾水，在20℃條件下，20 000 rpm勻漿1 min。于50℃水浴鍋靜置30 min，離心（5 000g，10 min，20℃），用pH計測量數值[5]。試驗重復3次。

1.2.4 干酪微生物指標的測定

稱取0.5 g Gouda干酪，無菌操作下研碎，無菌生理鹽水梯度稀釋，涂布于MRS固體培養基和M 17固體培養基上，于37℃培養箱中培養48 h，平板計數[6]。試驗重復3次。

1.2.5 干酪質構的測定

分別取成熟0周和12周的干酪樣品，室溫下放置2 h，利用TAXT plus型質構儀對干酪進行TPA分析。測量前探頭下降速度為1.0 mm/s；測試速度為1.0 mm/s；測量后探頭回程速度為5.0 mm/s；下壓變形為10 mm；觸發力為0.2 N；探頭類型為p/5。

1.2.6 水溶性氮（WSE/TN）含量測定

稱取20.0 g Gouda干酪碎塊，加入40 mL蒸餾水（50℃）勻漿（20 000 rpm，1 min）。40℃水浴鍋靜置1 h，離心（5000×g，15 min，20℃），上清定容至100 mL。取10 mL溶液消化后凱氏定氮[7]。試驗重復3次。

1.2.7 70%乙醇可溶性氮（70%Ethanol-SN）含量測定

20 mL WSE-SN溶液添加46.7 mL無水乙醇，震蕩混勻后，室溫提取 1 h，離心（5 000×g，15 min，20℃），上清液旋轉蒸發15 min，加蒸餾水定容至50 mL。取10 mL溶液進行消化后凱氏定氮[8]。試驗重復3次。

1.2.8 5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量測定

10 mL WSE-SN溶液依次添加7 mL 3.95 mol/L硫酸溶液和3 mL 33.3%（V/V）磷鎢酸溶液，震蕩混勻后，4℃靜置過夜。離心（5 000×g，15 min，20℃），過濾，上清用蒸餾水定容至25 mL。取10 mL溶液凱氏定氮[9]。試驗重復3次。

1.2.9 干酪游離氨基酸成分的測定

取成熟12周的Gouda干酪研碎，稱取30 mg樣品，加20 mL 6 mol/L鹽酸和100μL巰基乙醇，混合均勻，充氮氣2 min，密封水解管，置于110℃水解24 h。水解完成，取0.3 mL水解液，試管濃縮儀真空蒸發至干燥（60℃），溶于3 mL樣品稀釋液中，離心，上清經0.22μm微孔濾膜過濾，利用氨基酸分析儀檢測干酪中的游離氨基酸。

分析條件：分析柱LCAK06/Na(150×4.6 mm)，梯度洗脫，循環時間為58 min，分離柱溫度58℃，反應株溫度130℃，緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮衍生液流速0.25 mL/min，洗脫液流速0.45 mL/min，紫外檢測器，脯氨酸紫外檢測波長：440 nm，除脯氨酸外其他氨基酸紫外檢測波長：570 nm

1.2.10 干酪中脂肪酸成分的測定

取成熟12周的Gouda干酪研碎。游離脂肪酸的提取和甲酯化參考Aldo等的方法操作[10]。采用GC-MS方法進行樣品分析。色譜條件：氣相色譜6 890 N；彈性石英毛細管柱為SE-54，30 m×0.25 mm×0.25μm；氣化室溫度250℃；程序升溫80～290℃(4℃/min)，恒溫 30 min；載氣 He；載氣流量 1.2 mL/min；線速度40 cm/s；容積延遲3 min；進樣量1μL。各組分經過GC/MS分析，各峰對應的質譜圖與美國標準譜庫NIST02L對照檢索，確定出化合物類型，用內標法確定各脂肪酸成分的含量。

2 結果與討論

2.1 L.plantarum S72對干酪基本理化指標的影響

由表1的結果可以看出，對照組Gouda干酪與添加L.plantarumS72作為輔助發酵劑制備的Gouda干酪，在理化成分上稍有差異。

商品發酵劑對照組Gouda干酪和添加L.plantarumS72的Gouda干酪的pH值相差不大，在干酪成熟期中pH值均略有下降。在成熟過程中，添加L.plantarumS72的Gouda干酪和商品發酵劑組干酪相比，蛋白質、脂肪含量及脂肪占干物質的含量（Fat in Dry Matter：FDM）比值無顯著變化。相關研究也表明在成熟過程中，干酪的理化性質（蛋白、脂肪含量，濕度，pH等）不會發生顯著變化[11]。

表1 L.plantarum S72對干酪理化指標的影響

2.2 L.plantarum S72對干酪質構的影響

Gouda干酪的質構與干酪的組織結構及狀態有關，它決定了干酪的口感、滋味等。由表2的結果可以看出，隨著干酪的成熟，干酪的硬度逐漸增加，添加L.plantarumS72的Gouda干酪與商品發酵劑組Gouda干酪的質構指標基本一致，這說明在Gouda干酪的加工中加入益生菌對于干酪本身的硬度、咀嚼度、彈性等方面無顯著影響。Daigle等將鼠李糖乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌添加到農家干酪中，不但獲得了較高的活菌數，而且對農家奶酪的硬度、咀嚼度等產品品質沒有不良影響[12-13]。而Sheehan等的研究結果表明，加入具有蛋白水解能力的菌株后，干酪的硬度及彈性顯著低于對照組，尤其是在成熟期大于60 d以后[14]。

表2 干酪成熟過程中質構指標的變化

2.3 Gouda干酪成熟過程中活菌數的變化

表3 干酪成熟過程中微生物指標分析

由表3的結果可以看出，在干酪成熟過程中商品發酵劑對照組和S72組干酪球菌存活數差異不顯著，隨干酪成熟時間延長活菌數逐漸降低。添加L.plantarumS72干酪成熟2周后，乳桿菌活菌數由9.38±0.14 Log cfu/g增加到10.59 Log cfu/g，隨成熟期的延長活菌數逐漸下降，但成熟12周干酪中乳桿菌活菌數為9.40 Log cfu/g，說明Gouda干酪有助于益生性性乳桿菌的存活。Lynch[15]等的研究表明，在切達干酪制作過程中加入輔助發酵劑后，輔助發酵劑菌株保持較高的活菌數，且不影響球菌主發酵劑菌株的存活，我們的研究結果與其一致。

2.4 Gouda干酪成熟過程中水溶性氮（WSE/TN）含量的變化

本實驗利用水溶性氮占總氮的百分比（WSE/TN）確定干酪的初級蛋白水解程度，并作為Gouda干酪成熟程度的指標。此外，干酪中的大部分風味物質都在水溶性氮中[16]。由圖1可知，成熟期間對照組干酪的WSN/TN比值由2.03%增加至8.12%，在成熟過程中，各階段相差不大。而商品發酵劑+S72組干酪的WSN/TN比值均高于商品發酵劑組干酪，是因為益生菌L.plantarumS72具有較高的蛋白水解活性，能促進蛋白質水解成氨基酸和多肽。相關研究也表明隨著成熟時間的延長，奶酪中的可溶性氮含量增加，并且在180 d達到最大值[11]。

圖1 干酪成熟過程中水溶性氮的變化

2.5 Gouda干酪成熟過程中70%乙醇可溶性氮（70%Ethanol-SN）含量的變化

圖2 干酪成熟過程中70%乙醇可溶性氮的變化

如圖2所示，在Gouda干酪成熟過程中，試驗組干酪70%Ethanol-SN比值均略高于對照組。70%乙醇可溶性氮中含有氨基酸、大分子肽類及含氮化合物等物質。研究結果表明，Gouda干酪加工過程中添加L.plantarumS72益生菌株會提高干酪中各種功能性肽含量。本研究中，我們的檢測結果表明干酪后熟時間為12周時，70%Ethanol-SN的數值達到最高，推測隨著后熟時間延長，70%Ethanol-SN數值仍然會增加。進一步分析深層原因可能是在干酪后熟過程中，中等分子量的多肽和酪蛋白逐漸被各種酶類分解成低分子量的多肽和氨基酸，而后者可溶于70%乙醇中。Pappa等的研究表明在奶酪后熟期間，高分子量及中分子量多肽和酪蛋白被乳酸菌自溶釋放的各種酶水解成低分子量多肽和氨基酸等物質，而這些物質可溶解于70%乙醇，所以70%Ethanol-SN成分會增加[17]。這與我們的推測一致。

2.6 Gouda干酪成熟過程中5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量的變化

由圖3可知，5%磷鎢酸可溶性氮（PTA-SN）含量的變化與70%Ethanol-SN相似，在Gouda干酪成熟過程中5%PTA-SN的含量也呈增加趨勢，商品發酵劑+S72組干酪5%PTA-SN含量高于商品發酵劑組。5%PTA-SN中含有游離氨基酸、小分子量肽類和小分子量含氮化合物組成。根據我們的檢測數據（待發表），L.plantarumS72肽酶活性較強，有助于酪蛋白酶解生成游離氨基酸和肽類物質，從而增加5%PTA-SN的含量。說明L.plantarumS72益生菌作為輔助發酵劑，具有促進蛋白水解的作用。

圖3 干酪成熟過程中5%磷鎢酸可溶性氮的變化

2.7 Gouda干酪成熟過程中游離氨基酸含量的變化

Gouda干酪中的游離氨基酸含量能夠直接影響干酪的味道和風味。干酪成熟過程中，乳酸菌自溶，釋放出具有各種肽酶，將小肽進一步分解生成游離氨基酸。圖4是商品發酵劑制備的Gouda干酪和添加L.plantarumS72作為輔助發酵劑制備的Gouda干酪在成熟12周后對其游離氨基酸含量進行測定的結果。商品發酵劑+S72組干酪中各種游離氨基酸的含量均高于商品發酵劑組。添加L.plantarumS72后，提高了Gouda干酪成熟期間游離氨基酸含量，這有助于增加Gouda干酪的風味。與我們的研究結果相似，Sonia等的研究結果表明，加入輔助發酵劑后，干酪中的總游離氨基酸量略高于未添加輔助發酵劑組[18]。

Asp：天門冬氨酸；Thr：蘇氨酸；Ser：絲氨酸；Glu：谷氨酸；Ala：丙氨酸；Val：纈氨酸；Met：蛋氨酸；Ile：異亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：組氨酸；Lys：賴氨酸；Arg：精氨酸；Pro：脯氨酸

圖4 植物乳桿菌S72對干酪中游離氨基酸組分的影響

2.8 Gouda干酪成熟過程中脂肪酸含量的變化

干酪中的脂肪酸和氨基酸是主要的風味前體物質，對Gouda干酪形成特有的風味發揮重要作用。干酪中的脂肪酸不但是直接的風味化合物，而且是第二大主要風味物質甲基酮形成的底物。圖5是兩組干酪在成熟12周后脂肪酸含量的測定結果，從圖中可以看出，商品發酵劑組干酪和添加L.plantarumS72的Gouda干酪脂肪酸組成和含量差別不大。其中棕櫚酸和油酸含量較高，均超過25%，棕櫚油酸、亞油酸和亞麻酸相對百分含量均低于5%。研究表明在美國生產的切達干酪中添加食品級脂肪酶有助于其強烈風味的形成。而當干酪中的脂肪酸高于正常水平時，將在干酪成熟的任何階段都有損風味的平衡而不能形成特征風味，干酪中游離脂肪酸含量從0.3～100 mg/kg能很好的促進干酪的風味[19]。

圖5 L.plantarum S72對干酪中游離脂肪酸的影響

3 結論

綜上所述，L.plantarumS72作為益生菌和輔助發酵劑應用于Gouda干酪中，L.plantarumS72對干酪的一般理化指標、質構特性等無顯著影響，但在干酪成熟期間保持較高的活菌數。添加L.plantarumS72的Gouda干酪中WSE/TN，70%Ethanol-SN，5%PTA-SN和游離氨基酸的含量高于商品發酵劑組干酪，說明L.plantarumS72有助于干酪促熟和風味的形成。L.plantarumS72是一株在干酪加工中有較好應用前景的益生菌輔助發酵菌株。