動物腸道屏障功能對腸道菌群變化的調控

張小鳳 郭雁君 蔣惠

摘要：動物腸道屏障系統是機體同外界環境接觸并且相互作用的最大區域，也是病原體入侵的主要門戶。因此，完整和高效的動物腸道屏障系統對調控腸道病原微生物的侵入至關重要。通過介紹腸道屏障系統的構成，綜述了不同腸道屏障系統對腸道菌群變化的調控作用。

關鍵詞：動物；腸道屏障；腸道菌群；腸道黏液層；腸道上皮層；腸道免疫層

中圖分類號：Q48 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）12-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.001

Abstract： The animal's intestinal barrier system is the largest area where the organism contacts and interacts with the external environment， and is also the largest portal for pathogen invasion. Therefore， a complete and efficient animal intestinal barrier system is essential for regulating the invasion of intestinal pathogenic microorganisms. By introducing the composition of the intestinal barrier system， the regulatory effects of different intestinal barrier systems on the changes of intestinal flora were reviewed.

Key words： animals； intestinal barrier； intestinal flora； intestinal mucus layer； intestinal epithelium； intestinal immune layer

腸道是動物體內代謝活躍且具有獨特免疫功能的器官，同時又是體內最大的細菌庫，在機體消化、吸收、代謝和免疫等機能活動中具有重要的作用。研究表明，當腸道菌群發生紊亂后，屏障功能出現損傷，大量細菌和毒素經由門靜脈和淋巴系統進入體循環內，這將出現細菌易位及內毒素血癥，進一步引發全身炎癥反應綜合征和氧化應激，最終觸發多器官功能衰竭，所以人們廣泛認為腸道是導致全身性炎癥反應和氧化應激的始動器官。腸道屏障作為將腸腔與機體內環境分隔開來具有完善的功能隔離帶，人們通常將其分為機械、生物、免疫及化學屏障。但為了便于理解腸道菌群紊亂與腸道損傷的作用機制，本文將腸道屏障分為腸道菌膜層、腸道黏液層、腸道上皮層和腸道黏膜免疫層。

1 腸道菌膜層

動物胃腸道中包含約1013～1014個微生物，并由此腸道微生物與宿主腸道上皮之間保持著動態平衡，共同維持著腸道內環境的穩定[1]。腸道內菌群分布呈明顯的縱軸性，細菌與腸黏膜或結合、或黏附、或嵌合，組成有一定規律的膜菌群，形成菌膜屏障結構，通過競爭性限制病原體腸黏膜位點定植、競爭性抑制病原體營養物質攝入產生代謝物直接抑制病原體、激活腸道黏膜免疫反應等多種方式，抑制腸道內病原微生物的過度生長，限制其黏附于腸黏膜[2]（圖1）。腸道黏膜上皮由不同的腸上皮細胞亞群（Intestinal epithelial cells，IECs） 組成，包括M細胞（M cells）、杯狀細胞（Goblet cells）、潘氏細胞（Paneth cells）、腸內分泌細胞（Enteroendocrine cells）和柱狀腸上皮細胞（Enterocytes）。腸道上皮將機體同外部環境分離，避免遭遇有害抗原如致病性細菌、病毒和致病性共生菌的侵入[3]。腸道共生菌群對于機體溫和或者生理可接受水平的信號刺激以及腸道黏膜免疫體系的發育和維持具有重要的作用，其同腸道黏膜屏障共同構成體內防御腸道有害物入侵的第一道防線[4]。然而，腸道菌群之間的動態平衡易被打破，應激刺激可通過神經內分泌反應作用于腸道微生物，破壞腸道微生態系統。腸道微生物和上皮細胞或免疫細胞之間動態平衡被破壞和擾亂后，將導致腸道菌群比例、數量、種類、位置發生改變，引起腸道菌群紊亂，造成致病菌過度生長[2，5]，腸道共生菌的紊亂和致病菌的過度生長會使腸道細菌毒素物質迅速增加，引起腸道炎癥反應等病變。

2 腸道黏液層

腸道上皮細胞被一層厚且密實的黏液凝膠所完全覆蓋，這層黏液凝膠被稱為黏液層。黏液層由多種生物活性分子構成，包括黏蛋白、糖蛋白、三葉因子、抗菌肽和分泌型IgA（sIgA）等。腸道黏液層大體由內層（inner layer）和外層（outer layer）構成，黏液內層和外層厚度不一，受不同腸段和腸道菌落構成的影響，內層厚度大約50 μm，外層厚度大約100 μm。黏液層內層和外層蛋白組成基本相同，但是在黏液內層黏蛋白2（Muc2）濃度要遠大于黏液外層，高濃度的Muc2為黏液內層提供了牢固黏附在上皮細胞層的能力，并限制了共生菌在黏膜內層的定植，抑制腸道菌群與腸上皮的接觸。共生細菌通常定植在黏液外層，這表明腸道黏液內層具有強效的抵御病原體的能力[6]。當腸道菌群紊亂時，病原體會激活腸道黏液降解酶如糖苷酶的活性，糖苷酶則將腸道黏液降解為單糖，破壞黏液層的結構，出現病原體接觸宿主腸上皮、激活腸道黏膜的免疫反應[7]。

3 腸道上皮層

腸道上皮層是體內最大的黏膜表層，其表面積大于300 m2，由不同的IECs組成，包括腸道多能干細胞、M細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、腸內分泌細胞和柱狀上皮細胞[8]（圖2）。腸道上皮是成熟哺乳動物自我更新頻率最高的組織，平均3-4 d腸上皮細胞將更新一次。不同IECs協同作用構成機體生理屏障，分泌消化酶，參與營養物質吸收和代謝，感應抗原刺激，分泌抗菌蛋白，激活腸道黏膜免疫應答反應，維持腸道內環境穩態，保證腸道消化、吸收、代謝和免疫等機能正常活動[9]。

3.1 腸道干細胞

腸道干細胞（Pluripotent intestinal epithelial stem cells，pluripotent ISECs）主要起到更新腸上皮的作用。腸上皮細胞除潘氏細胞外，可不斷由隱窩底部向腸絨毛移行、分化并逐漸衰老、脫落，進行更新和修復，隱窩內的不同位置細胞處于不同的分化時期。隱窩底部的多能性腸上皮細胞干細胞不斷增殖和分化，形成不同的腸道上皮細胞[10]。

3.2 腸道杯狀細胞

杯狀細胞是腸道主要的內分泌細胞，其在腸上皮細胞中的數量由十二指腸（約4%）到結腸末端（約16%）逐漸增加[10]。杯狀細胞分泌的黏蛋白、三葉肽（TFF3），Fcγ-結合蛋白、抵抗素樣分子β（RELMβ）在腸道黏液層的形成中具有重要作用。黏蛋白是構成黏液層的主要成分，蛋白分子TFF3可以促進黏蛋白之間相互作用，構成網狀結構，促進上皮細胞修復并抑制其凋亡。而RELMβ通過促進杯狀細胞分泌黏蛋白，調節巨噬細胞在炎癥中的反應[7]。所以杯狀細胞通過影響黏液層的構成，在腸道菌群的定植和維持腸道微環境的穩定中扮演了重要的作用。

3.3 內分泌細胞

內分泌細胞和杯狀細胞一樣，也是體內的分泌細胞，約占腸上皮細胞總數的1%。腸道內分泌細胞可分泌不同的激素和神經遞質作用于腸道，對維持腸道結構和功能完整具有重要的作用[11]。雖然腸道內分泌細胞和腸道菌群結構之間互作關系尚未完全闡明，但研究報道指出，當機體遭到應激時，大腦會整合應激刺激，通過交感和副交感神經作用于腸道上皮內的分泌細胞，使去甲腎上腺素大量分泌，通過影響黏液分泌改變腸道蠕動，并且通過促進病原體的生長和定植等方式，改變腸道菌落環境，影響腸道穩態[12，13]。

3.4 柱狀腸上皮細胞

柱狀腸上皮細胞呈高柱狀，是小腸黏膜上皮中最主要的細胞，數量最多。相鄰柱狀細胞之間通過緊密連接蛋白、黏附連接蛋白和橋粒形成緊密連接結構，能防止腸腔內細菌、毒素和炎癥介質等抗原經細胞間隙穿過上皮細胞層進入周圍組織。柱狀腸上皮細胞具有一定的內分泌作用，能夠產生堿性磷酸酶對腸道病原體主要代謝物LPS起到脫毒作用。柱狀腸上皮細胞質膜基底部具有免疫球蛋白結合受體，通過胞轉作用，將黏膜層底部的IgA轉化為sIgA，用于緩解病原體毒性。另外，柱狀腸上皮細胞分泌的糖蛋白可在其游離面的微絨毛表面形成一層較厚的細胞衣，并且細胞衣的糖蛋白與細胞膜的蛋白質和脂質牢固結合，對腸上皮細胞能產生保護作用，是腸道機械屏障的主要結構。

3.5 M細胞

M細胞主要位于腸道濾泡上皮（Follicle-associated epithelium，FAE），覆蓋著腸道次級淋巴結構。M細胞具有特殊的形態結構，與腸細胞不同，M細胞的質膜頂端具有短小、不規則的微絨毛，便于腸道微生物與M細胞的頂端接觸和胞轉。M細胞刷狀緣消化酶的活性很低，因此消化和吸收不是M細胞的主要功能。此外，在M細胞質膜的頂端具有識別和結合細菌鞭毛蛋白FimH的糖蛋白GP2，而在M細胞質膜的基端，具有包含B細胞、T細胞等淋巴細胞和樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）、巨噬細胞等抗原呈遞細胞的口袋狀微皺結構，這種特殊的結構使病原體易于和M細胞結合，并胞轉進入固有層的病原體與免疫細胞樹突狀細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞上的PRR受體相作用，從而啟動體內免疫反應，以維持腸道和菌落穩態。研究報道指出，多種病原微生物能夠通過M細胞侵入宿主固有層，因此M細胞又被稱為腸道屏障的“阿喀琉斯之踵”[14]。

3.6 潘氏細胞

潘氏細胞是位于腸隱窩底部的漿液性腺上皮細胞，其主要特征是細胞內含有大量內質網和高爾基體，用于產生細胞質顆粒如溶菌酶、ⅡA 型分泌性磷脂酶A2（GroupⅡA secreted phospholipase，ⅡAsPLA2）、防御素（Defensin）、血管生成素4（Angiogenin 4，Ang4）、C-型凝集素（RegⅢγ）等多種抗菌肽，以殺滅病原體，抑制菌群在腸道上皮的定植，維持腸道穩態[15]。潘氏細胞上的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）能識別腸道內致病性和非致病性病原體的結構組成部分，如脂多糖和磷脂壁酸等，誘導潘氏細胞表達和分泌抗菌蛋白[16]；并且有助于腸黏膜的先天性免疫，主要是通過感知腸道有害細菌后釋放出具有殺菌活性的物質，其主要是α-防御素。潘氏細胞分泌的防御素可在腸隱窩局部維持較高的濃度，從而保護鄰近的細胞免受腸道病原體的侵襲，同時，可以有選擇地殺滅腸道內的共生菌，從而維持腸道內的正常菌群組成和動態平衡性[17]。

4 腸道黏膜免疫層

腸道黏膜免疫系統由腸道彌漫分布的淋巴細胞和腸黏膜相關性淋巴組織（Gut-associated lymphoid tissue，GALT）構成。前者包括腸上皮間淋巴細胞和固有層等處的淋巴細胞，后者由派氏結、腸系膜淋巴結和盲腸等部位的淋巴組織構成。腸上皮間淋巴細胞、派氏結、固有層淋巴細胞直接參與了對腸道中抗原的處理和免疫反應，它們在保障黏膜完成正常生理功能的同時避免病原體的入侵、維持腸道內穩態。由于它們所處的環境與腸黏膜密切相關，因此也統稱為腸道黏膜免疫系統（Intestinal mucosal immune system，IMIS）[18]。按功能可將腸道黏膜免疫系統分為兩個部分，一個是免疫應答的“誘導部位”（Inductive sites），由一些腸道的淋巴組織和散在的淋巴細胞組成；另一個是免疫應答的“效應”部位（Effector sites），如腸道黏膜固有層中的淋巴細胞。抗原到達腸腔后，在誘導部位被抗原提呈細胞捕獲、加工處理并提呈給免疫活性細胞，誘發免疫應答[19]。免疫反應產生的一個限制性步驟就是抗原識別、處理與呈遞，參與腸道黏膜抗原提呈的細胞及分子數量多、種類多，相互作用復雜，并且有其特有的性質。

4.1 黏膜監視

腸道黏膜免疫系統在對無害抗原的免疫耐受和對有害抗原的免疫應答中必須處于微妙的動態平衡，才能維持機體健康，準確識別有害、無害抗原以及對有害抗原產生迅速有效的免疫反應，這對機體來說至關重要。腸道上皮細胞對腸道微生物結構和組成的迅速感應對于維持腸道結構和功能的完整性具有重要作用，是啟動固有免疫的關鍵。Xavier等[19]首次提出黏膜監視器（Mucosal monitors）這一概念，因為腸道上皮中有大量的敏感細胞群如M細胞和潘氏細胞，其作為腸道黏膜“監視者”，通過模式識別受體（Pattern-recognition receptor，PRR）識別微生物結構成分-病原體相關分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP），從而迅速感覺腸道菌群的變化，一方面通過促進M細胞和潘氏細胞分泌抗菌肽的方式清除病原體，另一方面可通過信號傳導至黏膜免疫細胞，經過黏膜免疫細胞（DCs、單核吞噬細胞、B淋巴細胞）的激活和靜息，對腸道菌落做出適度的響應，以維持腸道內環境穩態。目前研究較多的PRR有Toll樣受體家族、核苷酸結合寡聚化結構域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）蛋白家族、RIG-I樣受體（RIG-I-like receptor，RLR）家族，相應的PAMP有脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）、脂質A、脂磷壁酸、脂蛋白、脂肽和含非甲基化CpG基序的寡聚核苷酸（CpG-ODN）等[20]。

4.2 腸道樹突狀細胞和腸道巨噬細胞

腸道菌群持續紊亂時，天然免疫（Innate immunity）和獲得性免疫（Adpative immunity）之間的相互作用在清除病原體的過程中發揮著重要的作用。機體感染病原體后，天然免疫細胞首先發揮作用，當天然免疫不能夠徹底清除病原體時，獲得性免疫隨之產生。巨噬細胞和樹突狀細胞這兩種關鍵的免疫細胞對于天然免疫向獲得性免疫的轉化至關重要。黏膜組織的淋巴樣器官（Peyers patches，PP結）和固有層（Lamina propria，LP）內存在大量的樹突狀細胞和巨噬細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞是兩種重要的免疫細胞，在天然免疫和獲得性免疫過程中具有不可或缺的作用。在天然免疫中，巨噬細胞主要通過吞噬作用殺傷和清除病原體及異物，并釋放多種炎性因子介導炎癥反應，在獲得性免疫中主要發揮免疫調節及抗原提呈功能。而樹突狀細胞是最重要的專職抗原提呈細胞（Antigen-presenting cells，APCs），是天然免疫和獲得性免疫間的“橋梁細胞”。

長久以來，樹突狀細胞都被認為是惟一能夠顯著刺激初始型T細胞增殖的抗原提呈細胞，而巨噬細胞和B細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞。黏膜樹突狀細胞表達緊密連接蛋白，其水平受細菌或細菌產物調節，樹突狀細胞通過緊密連接蛋白與附近的上皮細胞在結構上建立緊密的連接，維持腸道上皮屏障結構和功能的完整性。當腸道菌群紊亂時，固有層的樹突狀細胞能夠打開鄰近上皮細胞間的緊密連接，延伸樹突至腸腔捕獲細菌直接穿越黏膜上皮。無數個延伸的突觸形成網絡結構，感受腸道穩態的變化，將信號傳至固有層，并且這種抗原攝取方式受到CX3CL1（上皮細胞產生的一種趨化因子）的調節。在CX3CR1受體基因敲除的小鼠體內，樹突狀細胞被趨化至腸腔，但不能延伸樹突穿越上皮細胞，小鼠對沙門氏菌感染敏感性提高。這種調節的分子機制可能是CX3CR1與它的配體相互作用調節緊密連接蛋白的表達，因為緊密連接蛋白是樹突狀細胞在上皮細胞間匍匐延伸所必需的分子[21]。

巨噬細胞通過模式識別受體與抗原異物結合后，再通過胞吞和胞飲作用將其攝入細胞內，經殺菌系統殺傷病原體，后在多種溶解酶作用下降解消化細菌。殺菌系統包括氧依賴和非氧依賴兩種，前者包括活性氧中間物和活性氮中間物，通過呼吸爆發作用激活膜上還原性輔酶，活化分子氧，生成的活性氧具有殺菌作用；后者主要通過酸性pH、溶菌酶、防御素等裂解殺傷抗原異物。此外，巨噬細胞表面有MCP-1、IFN-γ、巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）等細胞因子的受體，感染部位組織細胞產生的MCP-1、IFN-γ、MCSF等細胞因子與其表面相應受體結合，招募并活化巨噬細胞，增強其吞噬殺菌能力。與此同時，活化后的巨噬細胞通過多種途徑參與和促進炎癥反應，進一步增加炎癥因子的表達量。

5 小結

腸道菌群在維持機體腸道結構和功能的完整中具有重要作用，但是大量微生物的定植同時也給腸道帶來炎癥和感染的風險。正常生理狀態下，腸道黏膜系統與腸道菌群相互作用相互識別，維持精妙的動態平衡，發揮其生物學功能。但機體遭遇應激時，多種因素作用于腸道，導致腸道菌群紊亂。腸道微生物直接作用于腸道上皮表面，腸道監視細胞M細胞和潘氏細胞迅速反應，一方面通過促進抗菌肽的分泌直接抑制病原體，另一方面通過胞吞作用將病原體轉運至固有層，激活體內先天免疫反應。此外，腸道樹突狀細胞能直接打開細胞緊密連接，直接穿透腸上皮細胞，將信號分子傳遞至固有層，嗜中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞向感染部位聚集，同時作用于T細胞啟動獲得性免疫。腸道黏膜的免疫應答可以快速地把有機體和毒素吞噬掉，維持腸道內的環境穩定；但機體持續遭受應激時，過度的免疫應答會導致中性粒細胞在吞噬毒素的同時釋放出大量的氧自由基和炎癥因子，這將引起腸道上皮的損傷，進一步引發炎癥反應和自由基產生級聯反應。

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